ИСТИНА

Поли(АДФ-рибозил)ирование (ПАРилирование) гистонов и других ядерных белков, катализируемое поли(АДФ-рибоза)-полимеразами (ПАРП), способствует выживанию клеток в условиях постоянного воздействия на ДНК различных генотоксических агентов. Ингибиторы ПАРП рассматриваются в качестве перспективных фармакологических средств для терапии онкологических, сердечно-сосудистых, аутоиммунных и др. заболеваний. Каталитическая активность ПАРП в клетке регулируется взаимодействием его с ДНК/другими белками, посттрансляционными модификациями, а также низкомолекулярными клеточными метаболитами и ксенобиотиками. В данной работе для детального исследования механизмов регуляции каталитической активности ПАРП в клетке и для поиска новых ингибиторов предложен оригинальный подход, основанный на использовании необратимо пермеабилизованных адгезированных клеток. Исследования проводились на культурах кардиомиобластов крысы (линия Н9с2). Активность ПАРП оценивали по иммунофлуоресценции образующегося продукта реакции – поли(АДФ-рибозы). В качестве пермеабилизующего агента использовали дигитонин, способный избирательно удалять холестерин из внешней плазматической мембраны. Особенность предложенного метода заключается в том, что перед пермеабилизацией клеточный ПАРП переводится в ДНК-связанное состояние в условиях, препятствующих раннему запуску каталитической реакции. Применение нашего протокола позволяет беспрепятственно доставлять в ядро различные эффекторы фермента (субстрат – НАД+, небольшие белковые факторы, ингибиторы и др.) в строго заданных количествах. В докладе приводятся примеры использования разработанного метода для исследования выявленных ранее ингибиторов ПАРП. Предложенный подход открывает новые перспективы для изучения механизмов регуляции активности ПАРП в клетке и может быть использован для поиска новых ингибиторов фермента.