ИСТИНА

Объект исследования -формиатдегидрогеназа патогенных бактерий Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение взаимосвязи структура-функция рекомбинантной формиатдегидрогеназы из патогенных бактерий S. aureus. Задачи: 1) Исследование влияния N-концевой последовательности на уровень экспрессии и каталитические свойства SauФДГ при использовании клеток E. coli BL21 (DE3) Codon Plus/pLysS в качестве штамма-продуцента; 2) Исследование влияния природы компонентов буферных систем на каталитические свойства SauФДГ; 3) Белковая инженерия рекомбинантной SauФДГ с целью увеличения каталитической эффективности за счет снижения констант Михаэлиса по NAD+ методом рационального дизайна; 4) Оптимизация методики культивирования и выделения 2H, 15N, 13C - меченных препаратов SauФДГ для поиска сайтов связывания потенциальных ингибиторов ФДГ методом ЯМР и изучения подвижности аминокислотных остатков. Научная новизна. Изучено влияние N-концевой аминокислотной последовательности на уровень экспрессии и свойства SauФДГ. Впервые получена и охарактеризована полноразмерная форма. Показано отсутствие ферментативной активности у последней. В рамках данного исследования была разработана комбинированная буферная система, приводящая к двукратному увеличению каталитической эффективности SauФДГ. Выделено и охарактеризовано 25 новых мутантных форм формиатдегидрогеназы из S. аureus с использованием рационального дизайна, включающие замены в 17 каталитически значимых положениях. Показаны изменения в каталитических свойствах после введения выбранных замен, что подтверждает значимость данных положений для катализа. Для двух мутантных форм показано увеличение каталитической эффективности вследствие введения меньших по объему боковых заместителей. Проведен дизайн С-концевой области SauФДГ и показано ее критическое значение в катализе. Теоретическая и практическая значимость работы. На примере рекомбинантной формиатдегидрогеназы из S. аureus была продемонстрирована значимость пост-трансляционной модификации отщеплением части N-концевой аминокислотной последовательности. Было показано что только укороченная форма белка проявляет специфическую активность. Данный факт может быть полезен при исследовании дегидрогеназ из семейства стафилококковые. Данные, полученные при изучении влияния структура-функция формиатдегидрогеназы из S. аureus являются вкладом в систематическое исследование формиатдегидрогеназ из различных источников. На примере данного фермента были подтверждены или опровергнуты успешно используемые ранее приемы рационального дизайна. А также, проведена апробация новых стратегических подходов. Методология и методы исследования. В рамках данной работы были использованы следующие методы и подходы: биоинформатика (конструирование праймеров), методы генетической инженерии (полимеразная цепная реакция, рестрикция, лигирование), микробиологические методы и методы молекулярной биологии (трансформация, культивирование и экспрессия в клетках E. сoli), хроматографические методы (гидрофобная хроматография, гель-фильтрация), аналитические методы изучения физико-химических свойств ферментов (спектрофотометрия).