ИСТИНА

В последние десятилетия регенеративная медицина стала самым перспективным направлением биомедицины. Поскольку клинические исследования методов клеточной терапии и трансплантации тканеинженерных конструкций не показали ожидаемой эффективности, стала очевидна необходимость поиска подходов для стимуляции эндогенной регенерации и возможностей направленной регуляции этого процесса. Разработка таких подходов требует фундаментальных знаний о механизмах обновления и восстановления тканей, которые в настоящий момент интенсивно накапливаются в мировой науке. Целями данного проекта является выяснение механизмов обновления тканей и их восстановления после повреждения и создание научных основ для разработки новых методов регенеративной медицины. Установлено, что важнейшую роль в поддержании клеточного состава тканей и их восстановлении после повреждения играют стволовые клетки в сочетании с их микроокружением (нишей). В большинстве тканей организма человека необходимым компонентом таких ниш являются мезенхимные стволовые/стромальные клетки (МСК). Эти клетки могут регулировать пролиферацию, мобилизацию и дифференцировку тканеспецифичных стволовых клеток. Вместе с тем, МСК дают начало определенным типам клеток и матриксу стромы тканей. Важнейшими системными регуляторами активности стволовых клеток, в том числе их способности к направленной дифференцировке, могут являться гормоны, метаболиты и нейромедиаторы, поступающие из кровотока и нервных окончаний. Ранее, при выполнении проектов, поддержанных РНФ, на примере МСК жировой ткани человека мы установили, что стволовые клетки могут быть чрезвычайно гетерогенны в отношении способности отвечать на гормональный стимул, поэтому для получения дефинитивных результатов нами были разработаны подходы, обеспечивающие регистрацию событий в одиночных клетках. С помощью такого подхода ранее нами был обнаружен уникальный для постнатальных стволовых клеток механизм повышения чувствительности МСК к норадреналину при повторном действии того же гормона. При этом происходит переключение внутриклеточной сигнализации с цАМФ-зависимой на кальций-зависимый путь передачи сигнала [Tyurin-Kuzmin et al., 2016]. Однако остаются неизвестными как взаимосвязь обнаруженной нами гетерологической сенситизации с выбором направления дифференцировки МСК, так и сами молекулярные механизмы влияния гормонов и нейромедиаторов на дифференцировку этих клеток. В настоящем проекте будет детально исследован этот процесс, для чего мы будем применять имеющиеся у нас препаративный сортер и микроскоп, позволяющий регистрировать активацию путей внутриклеточной сигнализации в одиночных клетках. В результате выполнения проекта будет впервые установлена взаимосвязь между способностью МСК к рецепции гормонов и нейромедиаторов и выбором пути их дифференцировки в адипогенном и остеогенном направлениях; с помощью секвенирования РНК в одиночных клетках будут выявлены субпопуляции, различающиеся по способности к рецепции гормонов и нейромедиаторов, а также субпопуляции клеток, коммитированных в адипогенном и остеогенном направлениях; с помощью анализа состава кондиционированной среды МСК, обработанных гормонами или нейромедиаторами, и выявления ее компонентов, определяющих чувствительность МСК к действию гормонов, будет установлен вклад секреторной активности МСК в регуляцию их способности рецептировать гормоны и нейромедиаторы. Основным доказанным механизмом участия МСК в восстановлении тканей оказалась секреция биологически активных молекул, включая ангиогенные, нейротрофные, иммуномодулирующие, белки внеклеточного матрикса (ВКМ), факторы, стимулирующие метаболизм клетки, а также внеклеточные везикулы, и переносимые ими некодирующие РНК, в том числе регуляторные микроРНК. В данном проекте с помощью современных методов транскриптомного и протеомного анализа будут исследованы про- и антифиброзные медиаторы, входящие в секретом МСК. Физиологическая роль отдельных молекул в составе секретома МСК будет установлена на модели фиброза in vitro с использованием методов редактирования генома. В проекте также будут изучены механизмы участия МСК в формировании ниши тканеспецифичных стволовых клеток и ее восстановлении после повреждения на примере жировой и тестикулярной ниши. В частности, будет проанализирована секреторная активность МСК и продукция ими белков внеклеточного матрикса в процессе формирования ниши; будут установлены механизмы взаимодействия стволовых клеток с МСК в процессе формирования ниши; с помощью иммунофлюоресцентного анализа будут оценены изменения состава и структуры ниши, а также секреторной активности входящих в нее клеток при повреждении ткани; будет исследовано влияние повреждения на активность (дифференцировочную способность, пролиферацию) стволовых клеток; будет идентифицировано стромальное микроокружение in vivo; будет создана модель формирования ниши in vitro. Решение задач проекта обеспечит значительный прогресс в понимании механизмов участия гормонов и нейромедиаторов в регуляции обновления клеточного состава тканей человека, роли МСК в репарации тканей. Будут обнаружены новые механизмы регуляции активности стволовых клеток, найдены новые способы предотвращения фиброза тканей. Разработка и внедрение новых подходов регенеративной медицины, направленных на стимуляцию эндогенной регенерации, позволит повысить продолжительность и качество жизни населения РФ.

In recent decades, regenerative medicine has become the most promising area of biomedicine. Since clinical studies of cell therapy and transplantation of tissue-engineered structures did not show the expected efficacy, the need to search for approaches to stimulate endogenous regeneration became obvious. The development of such approaches requires fundamental knowledge of the mechanisms of renewal and restoration of tissues, which is currently intensively accumulated in world science. The objectives of this project are to elucidate the mechanisms of renewal of tissues and their recovery after damage and to create scientific bases for the development of new methods of regenerative medicine. It has been established that the most important role in maintaining the cellular composition of tissues and their recovery after damage is played by stem cells in combination with their microenvironment (niche). In most tissues of the human body, mesenchymal stem / stromal cells (MSCs) are a necessary component of such niches. These cells can regulate proliferation, mobilization and differentiation of tissue-specific stem cells. Alongside with that, MSCs give rise to certain types of cells and the stromal matrix of tissues. The most important systemic regulators of stem cell activity, including their ability to differentiate, may be hormones, metabolites and neurotransmitters, coming from the bloodstream and nerve endings. Earlier, during the implementation of the projects supported by RSF, using human adipose-derived MSCs as a model object, we found that stem cells can be extremely heterogeneous in their ability to respond to hormonal stimuli, therefore, to obtain definitive results, we have developed approaches to record events in single cells. Using this approach, we previously discovered a mechanism of increasing sensitivity of MSCs to norepinephrine after the repeated application of this hormone, that's unique to postnatal stem cells. This occurs because MSCs intracellular signaling switches from cAMP-dependent to calcium-dependent [Tyurin-Kuzmin et al., 2016]. However, the relationship between the heterologous MSCs sensitivity (detected by us) and the choice of the direction of their differentiation as well as the molecular mechanisms of the influence of hormones and neurotransmitters on the differentiation of these cells remain unknown. In this project, this process will be studied in detail, for which we will use our preparative sorter and the microscope, which allows to register the activation of the pathways of intracellular signaling in single cells. As a result of the project, the interrelation between the ability of MSCs to receive hormones and neurotransmitters and the choice of the way of their differentiation in adipogenic and osteogenic directions will be established for the first time; using RNA sequencing in single cells, subpopulations that differ in the ability to receive hormones and neurotransmitters, as well as subpopulations of cells committed in adipogenic and osteogenic directions will be identified; by analyzing the composition of the conditioned medium of MSCs treated with hormones or neurotransmitters, and identifying its components that determine the sensitivity of MSCs to hormones, the contribution of MSCs secretory activity to the regulation of their own ability to receive hormones and neurotransmitters will be elucidated. The main mechanism of MSCs involvement in tissue repair was the secretion of biologically active molecules, including angiogenic, neurotrophic, immunomodulating, extracellular matrix proteins (ECM), factors that stimulate cell metabolism, as well as extracellular vesicles and non-coding RNA transferred by them, including regulatory miRNAs . In this project, with the help of modern transcriptome and proteomic analysis methods pro- and antifibrosis mediators in the MSCs secretome will be investigated. The physiological role of individual molecules in the MSCs secretome will be established on an in vitro fibrosis model using genome editing methods. The project will also examine the mechanisms of MSCs involvement in the formation of a tissue-specific stem cell niche and its recovery after damage using as models the adipose and testicular tissues. In particular, the secretory activity of MSCs and their production of extracellular matrix proteins in the process of niche formation will be analyzed; mechanisms of interaction of stem cells with MSCs in the process of niche formation will be established; using immunofluorescence analysis, changes in the composition and structure of the niche, as well as the secretory activity of its constituent cells in case of tissue damage will be assessed; the effect of damage on the activity (differentiation ability, proliferation) of stem cells will be investigated; the stromal microenvironment in vivo will be identified; an in vitro niche formation model will be created. Solving the project's tasks will provide significant progress in understanding the mechanisms of the participation of hormones and neurotransmitters in the regulation of the renewal of the cellular composition of human tissues, as well as the role of MSCs in tissue repair. New mechanisms for regulating the activity of stem cells will be discovered, new ways to prevent tissue fibrosis will be found. The development and introduction of new approaches of regenerative medicine aimed at stimulating endogenous regeneration will improve the duration and quality of life of the population of the Russian Federation.