ИСТИНА

Аннотация проекта (объемом не более 2 стр.; в том числе кратко – актуальность решения указанной выше научной проблемы и научная новизна) Данная информация может быть опубликована на сайте Фонда в информационно-телекоммуникационной сети «Интернет». на русском языке Актуальность начатого в 2016 году проекта сохраняется, поскольку гликирование белков при диабете играет особую роль в развитии различных осложнений, сопровождающих данное заболевание. При планируемом продолжении проекта главным направлением исследований будет изучение роли гликирования белков в возникновении и развитии нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы, поскольку именно при изучении модификации амилоидогенных белков сахарами и альдегидами были получены наиболее интересные результаты. Не менее важным представляется исследование участия гликолиза, эффективность которого изменяется при ряде нейродегенеративных заболеваний, в накоплении гликирующих альдегидов, модифицирующих белки. Мы надеемся, что проведение планируемых исследований будет полезным для понимания механизмов развития таких социально значимых заболеваний, как диабет, болезни Паркинсона и Альцгеймера и других амилоидных патологий, и, возможно, позволит найти новые способы их лечения и профилактики. Научная новизна проекта при его продлении будет заключаться, прежде всего, в выяснении механизмов обнаруженного в нашей работе влияния альфа-синуклеина на гликолитический фермент - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАФД). Было установлено, что изменение активности этого фермента приводит не только к замедлению гликолиза, но и к накоплению метилглиоксаля и глицеральдегид-3-фосфата, способных модифицировать белки, в том числе амилоидогенные. Необходимо установить, как изменяется взаимодействие двух белков при их модификации, в частности, при гликировании альфа-синуклеина и окислении и глутатионилировании ГАФД, а также выяснить участие этих процессов в патологической трансформации клеток. Кроме того, новым является выяснение влияния модификации белков глицеральдегид-3-фосфатом на их характеристики и эффективность взаимодействия с белками-партнерами, поскольку предварительные данные указывают на существенные отличия свойств белков, модифицированных двумя альдегидами – метилглиоксалем и глицеральдегид-3-фосфатом. Будет предложена концепция о взаимосвязи гликирования, гликолиза и нейродегенерации, учитывающая новые данные, полученные при реализации проекта. При продолжении проекта будут изучены факторы, влияющие на активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, поскольку ее инактивация прямо или косвенно стимулирует накопление глицеральдегид-3-фосфата и метилглиоксаля. Основное внимание будет уделено роли глутатионилирования ГАФД, которое, как было показано в наших работах, предотвращает необратимое окисление сульфгидрильных групп активного центра фермента активными формами кислорода. В частности, при сравнении ГАФД дикого типа с мутантной формой, содержащей замену 156 остатка цистеина на серин, будет изучено значение второго цистеинового остатка активного центра в предотвращении необратимой инактивации фермента. Будет изучен механизм инактивирующего действия гликирования на ГАФД, который, предположительно, заключается в инактивации сульфгидрильных групп белка активными формами кислорода, образующимися в процессе преобразования ранних продуктов гликирования (кетоаминов) в конечные продукты. Кроме того, будет продолжено изучение взаимодействия гликированного разными способами альфа-синуклеина с ГАФД как с помощью молекулярного моделирования, так и экспериментальными методами. Будут идентифицированы продукты модификации белков глицеральдегид-3-фосфатом для установления причин отличий в их свойствах по сравнению с белками, гликированными другими соединениями. Будут проведены исследования на клеточных линиях, продуцирующих разные формы альфа-синуклеина, для подтверждения установленных для изолированных белков сведений о роли гликирования в патологической трансформации клеток, содержащих амилоидогенные белки. В этих экспериментах будут использованы стабильные клеточные линии, полученные на основе транзиентно трансфицированных клеток с помощью метода отбора клонов, которые продуцируют альфа-синуклеин дикого типа или мутантный белок A53T. Будут выделены и охарактеризованы агрегаты альфа-синуклеина, и установлено влияние модификации этого белка в разных условиях гликирования на индукцию его агрегации и амилоидоизации. Особое внимание будет уделено предотвращению сумоилирования и убиквитинилирования гликированных белков. На заключительном этапе будет сделана попытка идентификации белков, модифицированных разными гликирующими агентами, в крови больных диабетом. Кроме того, необходимо продолжить работу по детальному изучению структуры обнаруженных нами необычных флуоресцирующих спиральных агрегатов, образующихся при взаимодействии в присутствии тиофлавина Т гликированного определенным образом бета-казеина и прионного белка. В дополнение к методам флуоресцентной и трансмиссионной электронной микроскопии будет использована специальная установка, в которой образец анализируется с помощью атомно-силового и одновременно флуоресцентного микроскопа. Проведение этих экспериментов необходимо для исключения ложноположительных результатов при детекции с помощью тиофлавина Т амилоидных структур при флуоресцентной микроскопии из-за его взаимодействия с гликированными белками. Увеличение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при его связывании с гликированными белками будет использовано для разработки метода детекции модифицированных сахарами аминокислотных остатков. Будет также продолжено изучение влияния синтетических и природных полимеров на амилоидную трансформацию нативных и гликированных альфа-синуклеина и прионного белка. Продемонстрированная возможность переключения амилоидной трансформации альфа-синуклеина на аморфную агрегацию в присутствии пиридиниевого поликатиона позволяет начать поиск природных полиэлектролитов, предотвращающих патологическую агрегацию амилоидогенных белков. Будет исследована способность полиэлектролитов предотвращать инфекционное воздействие прионного белка. Полученные результаты будут использованы для моделирования влияния различных заряженных макромолекул на развитие амилоидозов у человека, а также при поиске новых подходов к лечению этих заболеваний с использованием природных полимеров. На основе изучения указанных выше молекулярных механизмов влияния гликирования на индивидуальные белки, на энергетический обмен и на жизнедеятельность клеток будет предпринята попытка выяснить причины возникновения осложнений диабета и, прежде всего, развития нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы.

The project commenced in 2016 still has relevancy, since the glycation of proteins in diabetes mellitus plays a particular role in the development of various complications accompanying the disease. In the planned continuation of the project, research will be mainly focused on the role of protein glycation in the onset and development of neurodegenerative diseases of amyloid nature, since the most interesting results were obtained from studying the modification of amyloidogenic proteins by sugars and aldehydes. No less important is the study of glycolysis involvement, the effectiveness of which varies in a number of neurodegenerative diseases, in the accumulation of glycating aldehydes that modify proteins. We hope that this research will further the understanding of the development mechanisms of such socially significant diseases as diabetes, Parkinson's and Alzheimer's diseases and other amyloid pathologies, and, possibly, will allow us to find new ways for their treatment and prevention. The scientific novelty of the project continuation will primarily encapsulate clarification of the mechanisms of alpha-synuclein influence on the glycolytic enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD), previously discovered in our work. It was found that a change in the activity of this enzyme leads not only to the drop in glycolytic rate, but also to the accumulation of methylglyoxal and glyceraldehyde-3-phosphate, capable of modifying proteins, including amyloidogenic. It is necessary to establish how the interaction of the two proteins changes when they are modified, in particular, alpha-synuclein is glycated and GAPD is oxidized or glutathionylated. It is also important to clarify the involvement of these processes in the pathological transformation of the cells. In addition, new is the planned elucidation of the modification by glyceraldehyde-3-phosphate effect on protein characteristics and the efficiency of interaction with protein partners, since preliminary data indicate significant discrepancy in properties of proteins modified by methylglyoxal and glyceraldehyde-3-phosphate. A concept of the interconnection between glycation, glycolysis and neurodegeneration will be proposed, taking into account new data obtained during the project. As part of the continuing project, factors affecting the activity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase will be studied, since its inactivation directly or indirectly stimulates the accumulation of glyceraldehyde-3-phosphate and methylglyoxal. The main attention will be paid to the role of GAPD glutathionylation, which, as it was shown in our work, prevents the irreversible oxidation of sulfhydryl groups of the enzyme active center by reactive oxygen species. In particular, when comparing wild type GAPD with a mutant form containing a substitution of 156 cysteine ​​residue for serine, the value of the second cysteine ​​residue of the active center in preventing the irreversible inactivation of the enzyme will be studied. The mechanism of the inactivating action of glycation on GAPD, which, presumably, consists of the sulfhydryl groups inactivation by reactive oxygen species, formed during the conversion of early glycation products (ketoamines) into final products, will be studied. In addition, the study of glycated alpha-synuclein interaction with GAPD using both molecular modeling and experimental methods will continue. Protein modifications caused by glyceraldehyde-3-phosphate will be identified to establish the reasons for the discrepancy between them and proteins glycated by other compounds. Research will be conducted on cell lines producing different forms of alpha-synuclein to confirm information about the role of glycation in the pathological transformation of cells established previously for isolated proteins. In these experiments, stable cell lines derived from transiently transfected cells using limiting dilution cloning method, that produce wild type alpha-synuclein or A53T mutant protein will be used. Alpha-synuclein aggregates will be isolated and characterized, and the effect of modification of this protein under different glycation conditions on the induction of its aggregation and amyloidization will be established. Particular attention will be paid to prevention of sumoylation and ubiquitination of glycated proteins. At the final stage of the project, an attempt will be made to identify proteins modified by different glycating agents in the blood of diabetic patients. Apart from that, it is necessary to continue the work on a detailed study of the structure of unusual fluorescent spiral aggregates that was found to be formed during the interaction of prion protein and glycated in a certain way beta-casein in the presence of thioflavin T. In addition to fluorescence and transmission electron microscopy, a special equipment setup will be used, in which the sample is analyzed using simultaneously an atomic force microscope and fluorescent microscope. Conducting these experiments is necessary to eliminate false-positive results while detecting amyloid structures with thioflavin T under fluorescent microscope because of its interaction with glycated proteins. An increase in thioflavin T fluorescence intensity upon its binding to glycated proteins will be used to develop a method for detecting sugar-modified amino acid residues. The study of the effect of synthetic and natural polymers on the amyloid transformation of native and glycated alpha-synuclein and prion protein will also be continued. The demonstrated ability to switch amyloid transformation of alpha-synuclein to amorphous aggregation in the presence of pyridinium polycation allows beginning of the search for natural polyelectrolytes that prevent the pathological aggregation of amyloidogenic proteins. The ability of polyelectrolytes to prevent infectivity of prion protein will be investigated. The results will be used for simulation of various charged macromolecules effect on the development of human amyloidosis, as well as for the search of new approaches to the treatment of these diseases using naturally occuring polymers. Based on the study of the aforementioned molecular mechanisms of glycation effect on individual proteins, energy metabolism and cell functioning, an attempt will be made to find out the causes of diabetes complications and, above all, the development of neurodegenerative diseases of amyloid nature.

1. Будут выделены необходимые для исследования белки, а именно, разные формы рекомбинантной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) человека, рекомбинантного альфа-синуклеина человека, а также рекомбинантный овечий прионный белок. 2. Будут определены кинетические параметры мутантной формы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека с заменой 156 остатка цистена на серин, а также ее чувствительность к окислению, модификации восстановленным глутатионом и восстановлению каталитической активности низкомолекулярными тиолами в сравнении с белком дикого типа. 3. С помощью метода молекулярного моделирования будут определены параметры связывания нативной и глутатионилированной ГАФД дикого типа, а также ГАФД с заменой 156 остатка цистеина на серин, с немодифицированным или гликированным глицеральдегид-3-фосфатом альфа-синуклеином. 4. Будут определены параметры связывания гликированного и немодифицированного альфа-синуклеина с нативной и глутатионилированной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, а также влияние разных форм альфа-синуклеина на свойства ГАФД. 5. Будет определена эффективность сумоилирования и убиквитинилирования альфа-синуклеина в зависимости от степени его гликирования. 6. Будут получены данные о влиянии гликирующих альдегидов на энергетический статус клеток в зависимости от содержания в них разных форм альфа-синуклеина при использовании стабильных клеточных линий, продуцирующих этот белок. 7. Будут определены белковый состав агрегатов альфа-синуклеина, выделенных из стабильных клеточных линий, продуцирующих разные формы этого белка, а также эффективность гликирования белков, входящих в состав агрегатов. 8. Будут выяснены особенности влияния модификации метилглиоксалем или глицеральдегид-3-фосфатом прионного овечьего белка на его агрегацию и амилоидную трансформацию. 9. Будут разработаны подходы для использования синтетических и природных полиэлектролитов с целью предотвращения амилоидной трансформации альфа-синуклеина. 10. Будут получены сведения о строении флуоресцирующих спиральных структур, образующихся в присутствии тиофлавина Т при агрегации гликированного бета-казеина и прионного белка, необходимые для оценки возможных ложноположительных результатов детекции амилоидных структур при использовании этого красителя. 11. Будет предложен новый метод детекции гликированных белков с помощью тиофлавина Т. 12. Будут опубликованы, по крайней мере, две статьи в международных изданиях, включенных в системы цитирования Web of Science и/или Scopus. 13. Будут опубликованы 3 тезиса докладов в сборниках тезисов международных конференций. 14. На международных конференциях участниками проекта будет сделано 3 доклада о результатах работы.

Для реализации Проекта 2019 будут, в основном, использованы методы и подходы, примененные на предыдущем этапе, а именно: выделение индивидуальных белков, вовлеченных в развитие амилоидных нейродегенеративных заболеваний (альфа-синуклеина и прионного овечьего белка), гликирование белков различными реагентами и изучение влияния гликирования на их патологическую трансформацию. Будет продолжено исследование воздействия гликирующих агентов на различные аспекты функционирования клеток с использованием стабильных клеточных линий, продуцирующих альфа-синуклеин дикого типа или мутантный белок A53T. Будет продолжено использование метода молекулярного моделирования для изучения взаимодействия белок-белковых и белок-полимерных взаимодействий, а также применение традиционных подходов для количественной оценки связывания биополимеров друг с другом (метод поверхностного плазмонного резонанса, изотермической калориметрии титрования, динамического лазерного светорассеяния, аналитического ультрацентрифугирования и других). Для исследования строения белковых агрегатов и амилоидных структур наряду с флуоресцентной и трансмиссионной микроскопиями, будет применен новый подход с использованием установки, позволяющей одновременно исследовать образец с помощью атомно-силовой и флуоресцентной микроскопии. Будет использовано сочетание хроматографических методов и масс-спектрометрии для идентификации продуктов модификации белков при их обработке глицеральдегид-3-фосфатом и другими реагентами. Одним из новых подходов будет изучение сумоилирования и убиквитинилирования белков после их гликирования и проверка предположения о снижении эффективности деградации гликированных белков протеасомами.

1. Выделенные белки, а именно: две формы ГАФД (дикого типа hGAPDH и мутантная hGAPDH_C156S) (Рис. 1 А и Б), три формы альфа-синуклеина и прионный овечий белок были получены в гомогенном состоянии. Особо следует отметить, что все формы альфа-синуклеина и ГАФД не содержали каких-либо дополнительных мотивов и «тэгов», облегчающих выделение белков. Это позволило избежать загрязнения препаратов неправильно свернутыми полипептидными цепями, а в случае ГАФД – выделить ферменты, обладающие такой же удельной активностью, как и нативный белок (более 100 мкмолей субстрата в минуту на мг белка). Так, удельная активность белков hGAPDH и hGAPDH_C156S составила 118 ± 5 и 102 ± 5 мкмоль NADH / мин на мг белка при 25°C, соответственно, что совпадает с удельной активностью этого фермента, выделенного из мышц млекопитающих традиционными методами. При этом удельная активность рекомбинантных форм ГАФД, выделявшихся ранее с использованием «тэгов», не превышала 30% от активности нативных ферментов, а в большинстве случаев составляла 5-10%. 2. При определении основных кинетических параметров двух форм ГАФД (hGAPDH и hGAPDH_C156S) не было обнаружено существенных отличий. Однако чувствительность двух форм фермента к окислению перекисью водорода значительно отличалась. Константы скорости второго порядка для окисления hGAPDH и hGAPDH_C156S перекисью водорода составили 11,0 ± 0,4 М-1·с-1 для hGAPDH и 4,9±0,1 М-1·с-1 для hGAPDH_C156S. Таким образом, было показано, что мутация C156S снижает чувствительность hGAPDH к окислению приблизительно в 2 раза (Рис.2 В). Эксперименты по модификации фермента в присутствии GSH и H2O2 показывают, что в этом случае происходит глутатионилирование цистеина активного центра (Cys152), что защищает белок от необратимого окисления (Рис. 3 В). Образование глутатионилированного производного (Protein-SSG) в белках hGAPDH и hGAPDH_C156S после инкубации в присутствии GSH и H2O2 было доказано методом MALDI-MS анализа. 3. Ранее с помощью метода молекулярного моделирования было предсказано, что гликирование альфа-синуклеина должно усиливать его взаимодействие с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (ГАФД). Это предположение было подтверждено экспериментально (Semenyuk P. et al, 2019, https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.01.064). При исследовании методом молекулярного моделирования связывания нативной и глутатионилированной ГАФД дикого типа с немодифицированным или гликированным альфа-синуклеином было обнаружено, что ключевую роль в связывании играют положительно заряженные остатки, расположенные в районе анион-связывающей бороздки ГАФД, включающей активный центр фермента и NAD-связывающий сайт. Глутатионилирование остатка цистеина, расположенного в той же бороздке (Cys152), приводит к появлению объемной группы глутатиона в этом участке, причем появляются 2 дополнительные карбоксильные и одна амино-группы (Рис. 4). Таким образом, глутатионилирование приводит к снижению эффективности взаимодействия альфа-синуклеина с ГАФД, по крайней мере, тех его молекул, которые связываются в анион-связывающей бороздке фермента. При этом замена 156 остатка цистеина, расположенного в глубине активного центра молекулы фермента, на серин не приводила к существенным изменениям связывания альфа-синуклеина при моделировании. Следует, однако, отметить, что глутатионилирование и окисление 152 цистеинового остатка ослабляют связывание ГАФД с кофактором (NAD+), что, в свою очередь, влияет на связывание ГАФД с альфа-синуклеином, как было нами показано ранее. Таким образом, хотя глутатионилированная ГАФД должна связываться с альфа-синуклеином менее прочно, чем апоформа фермента, трудно предсказать различия в эффективности взаимодействия между глутатионилированной и связанной с кофактором немодифицированной формы ГАФД. 4. Эксперименты с использованием метода твердофазного иммуноферментного анализа не выявили достоверных отличий во взаимодействии нативной или глутатионилированной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с альфа-синуклеином. Вероятно, ослабление связывания альфа-синуклеина с ферментом из-за присутствия в активном центре ГАФД глутатиона, продемонстрированное при молекулярном моделировании, компенсируется выходом из NAD+ - связывающего сайта кофактора, связывание которого ухудшается из-за модификации сульфгидрильной группы 152 остатка цистеина. 5. При изучении гликирования, убиквитинилирования и сумоилирования альфа-синуклеина в клеточных лизатах не удалось выявить модифицированных форм этого белка с помощью иммуноблоттинга с использованием трех видов антител – на «конечные продукты гликирования», на белок SUMO-1 и на убиквитин. На следующем этапе работы мы планируем, во-первых, обогатить фракцию альфа-синуклеина в лизатах, либо осаждая другие белки методом кислотного осаждения (поскольку альфа-синуклеин устойчив к такому воздействию), либо с помощью иммунопреципитации из лизата антителами против альфа-синуклеина или убиквитинилированных белков. Кроме того, мы планируем оценить изменение скорости деградации альфа-синуклеина в присутствии гликирующих соединений, заблокировав синтез белка циклогексимидом, или в присутствии ингибиторов протеасомы MG-132 или лактацистина. 6. Исследование влияния гликирования на энергетический статус стабильных клеточный линий, продуцирующих разные формы альфа-синуклеина, показало, что инкубация с метилглиоксалем приводит в большинстве случаев к замедлению гликолиза. Синтез в клетках альфа-синуклеина также ухудшает энергоснабжение клеток за счет гликолиза, причем замедление гликолиза коррелирует с увеличением содержания в клетках мономерных, но не агрегированных форм альфа-синуклеина. 7. Получены in vitro и охарактеризованы олигомеры альфа-синуклеина. Олигомеры будут использованы для оценки влияния гликирования альфа-синуклеина на его способность инактивировать глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и регулировать эффективность гликолиза. Эксперименты по получению агрегатов альфа-синуклеина из стабильных клеточный линий, продуцирующих разные формы альфа-синуклеина, будут продолжены с учетом полученных на данном этапе результатов. 8. Доказано, что гликирование как метилглиоксалем, так и 3-фосфоглицериновым альдегидом изменяет вторичную структуру рекомбинантного овечьего прионного белка, препятствует его амилоидной трансформации, стимулируя аморфную агрегацию. При этом модификация 3-фосфоглицериновым альдегидом обладает более выраженным воздействием, вероятно, из-за присутствия в полученных производных фосфатной группы. 9. При изучении влияния различных полиэлектролитов на патологическую трансформацию альфа-синуклеина было показано, что некоторые полиэлектролиты могут предотвратить амилоидную агрегацию альфа-синуклеина (сульфонированные ароматические полианионы) или стимулировать аморфную трансформацию белка (ряд поликатионов). Полученные результаты позволяют предложить перспективный подход для предотвращения амилоидной трансформации альфа-синуклеина с помощью полиэлектролитов, прежде всего, природных. Кроме того, проведенные эксперименты представляют собой упрощенную модель поведения природных заряженных молекул, таких как сульфатированные полисахариды (гликозаминогликаны), потенциально способных влиять на амилоидную трансформацию альфа-синуклеина в организме пациентов, страдающих синуклеинопатиями. Следует отметить, что при рассмотрении общей картины процессов, происходящих при развитии синуклеинопатий, нельзя игнорировать роль природных полиэлектролитов. Влияние таких полиэлектролитов будет также зависеть от посттрансляционных модификаций альфа-синуклеина и должно изменяться, например, в результате его гликирования и фосфорилирования. По результатам это части проекта подготовлена журнальная статья (Semenyuk P., Kurochkina L., Barinova K., Muronetz V. «Alpha-synuclein amyloid aggregation is inhibited by sulfated aromatic polymers and pyridinium polycation»). 10. Продемонстрировано образование необычных флуоресцирующих структур, содержащих спиральные элементы, при совместной инкубации прионного белка, гликированного бета-казеина и тиофлавина Т. Форма обнаруженных структур зависит как от особенностей гликирования, так и от соотношения двух белков и условий инкубации. Формирование спиральных структур невозможно в отсутствие тиофлавина Т. Сделанное наблюдение необходимо учитывать при выявлении амилоидных белков с помощью метода, основанного на изменении интенсивности флуоресценции тиофлавина Т, во избежание ложноположительных результатов из-за взаимодействия красителя с гликированными белками, приводящего к формированию спиральных структур. 11. Было доказано, что можно идентифицировать гликированные глюкозой белки, исходя из интенсивности флуоресценции тиофлавина Т, связывающегося с конечными продуктами гликирования. Однако при этом необходимо учитывать вклад, который могут вносить взаимодействия красителя с бета-складчатыми структурами, а также возможность агрегации гликированных белков при добавлении к ним тиофлавина Т. Предложенный способ идентификации гликированных глюкозой белков больше подходит не для количественной оценки их содержания, а для качественного выявления гликированных глюкозой белков при флуоресцентной микроскопии. Особенно важно учитывать обнаруженное явление при идентификации амилоидных белков, чтобы избежать ложноположительных результатов. 12. Было опубликовано 5 журнальных статей в международных изданиях, включенных в системы цитирования Web of Science и/или Scopus. Из них 4 статьи были опубликованы в журналах, относящихся к Q1, по базе данных http://www.scimagojr.com. Кроме того, 3 тезисов докладов, сделанных на 2-х конференциях, были опубликованы в специальных выпусках журналов «Acta Naturae» и «International Journal of Biomedicine». Подготовлены и отправлены в редакции журналов 3 статьи по полученным результатам.