Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей средыНИР

Molecular design, structure-function analysis and regulation of enzyme systems, cellular structures, bionanomaterials: fundamental basis and applications in technology, medicine, environmental protection

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа: В 2021 г. были получены следующие результаты: Исследовано влияние поверхностно активных веществ (ПАВ) разной природы на бактериолитическую активность лизоцима по отношению к бактериям различных семейств, а именно Micrococcus luteus, Lactobacillus plantarum, Escherichia coli. Обнаружены общие закономерности влияния ПАВ на бактериолитическую активность фермента лизоцима. ПАВ различной природы дают схожий эффект изменения максимальной активности фермента без изменения константы Михаэлиса и без изменения положения pH-оптимума активности. Предполагается взаимодействие гидрофобной части ПАВ с неким центром связывания на поверхности фермента вне активного центра. С экспериментальными данными хорошо согласуется предложенная математическая модель, предполагающая присоединение 3 молекул ПАВ к ферменту. Данное явление с влиянием ПАВ на антибактериальную активность лизоцима может быть связано с существованием ранее неизвестного природного активатора гидрофобной природы. Получены препараты формиатдегидрогеназы из метилотрофных дрожжей, проведена кристаллизация и получены предварительные данные. В случае оксидазы Д-аминокислот (ДААО) клонированы гены двух новых ферментов, созданы экспрессирующие конструкции. Обе ДААО экспрессируются в активной и растворимой формах. Выявлены особенности взаимодействия литических полисахаридмонооксигеназ (ЛПМО) из Thielavia terrestris (TtLPMO), Penicillium verruculosum (PvLPMO) и Trichoderma reesei (TrLPMO) с очищенными целлобиогидролазами (ЦБГ I и ЦБГ II), а также с эндоглюканазой II (ЭГ II) P. verruculosum при ферментативном гидролизе различных форм целлюлозы. TtLPMO является ЛПМО C1-типа, тогда как PvLPMO и TrLPMO относятся к ЛПМО смешанного C1/C4-типа в соответствии с классификацией данных оксидоредуктаз. При использовании каждой из ЛПМО в смеси с ЦБГ II или ЭГ II в процессе деструкции кристаллической или аморфной целлюлозы ферменты демонстрировали синергизм, то есть повышался выход восстанавливающих сахаров (ВС) в результате ферментативной реакции. В случае композиций PvLPMO и TrLPMO с ЦБГ I также проявлялся синергизм, однако TtLPMO, напротив, демонстрировала антагонизм с ЦБГ I по выходу ВС из целлюлозы. Предложена простая кинетическая схема, объясняющая наблюдаемые эффекты. Показано, что по сравнению с анионными, катионные дендримеры образуют прочные комплексы с фибриногеном за счет сильных электростатических взаимодействий между плотно положительно заряженной поверхностью дендримеров и отрицательно заряженными участками белка. Изменение конформации фибриногена и его свертываемости тромбином является основным механизмом коагулопатии, вызываемой катионными денримерами. Показано, что С6S (при > 100 мкМ) демонстрирует сильное антикоагулянтное действие благодаря сильному ингибированию им активности тромбина. Напротив, комплексообразование с жесткой структурой C4S изменяет конформацию фибриногена и стимулирует его свертывание тромбином. Различия в эффектах С4S и 6S на процесс коагуляции обусловлены их размером, гибкостью и числом отрицательных зарядов. Показано, что K1-5 значительно сильнее, чем K1-4.5, ингибирует активацию плазминогена его активаторами в плазмин – ключевой фермент, инициирующий ангиогенез. Благодаря целостности крингла 5, K1-5 является более эффективным ингибитором ангиогенеза, чем известный ангиостатин К1-4.5. Для гибридных микрокристаллов с муцином по сравнению с контрольными микрокристаллами ватерита продемонстрирована большая сорбция положительно заряженных (доксорубицина и химотрипсина) и меньшая сорбция отрицательно заряженных (каталазы) биологически активных веществ. Гибридные микрокристаллы отличались лучшим удерживанием сорбированных биологически активных веществ, большим защитным действием по отношению к инактивации ферментов под действием температуры, органического растворителя и протеолиза, а также отсутствием перекристаллизации в более термодинамически стабильный кальцит. Гибридные микрокристаллы до и после обработки белками плазмы крови не вызывали разрушения мембран эритроцитов. Гибридные микрокристаллы по сравнению с контрольными микросферами ватерита обладали большей способностью стимулировать образование активных форм кислорода нейтрофилами. Полученные результаты открывают новые перспективы создания средств доставки биологически активных веществ на основе микрокристаллов ватерита с различной архитектурой. Разработаны системы доставки лекарственного препарата в глаз на основе неорганических кальций-фосфатных частиц, покрытых органическим полимером хитозаном. Разработана аналитическая платформа на основе ГКР-спектров для идентификации гликоформ ангиотензин-превращающего фермента, продуцируемого разными типами клеток. Определено содержание хитозана в CaP-частицах, покрытых 5 кДа хитозаном (13 %)и 72 кДа гликоль-хитозаном (45%). Исследование покрытых хитозанами частиц с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показало, что покрытые 5 кДа хитозаном частицы имели форму «стержня» со средней длиной 200 нм, а покрытые 72 кДа гликоль-хитозаном шарообразную форму диаметром около 250 нм. Ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) эналаприлат в составе частиц удерживался в слезной жидкости кроликов эффективнее, чем свободный. Продемонстрировано усиление микроциркуляции глаза под действием эналаприлата. Введение эналаприлата в составе СаР-частиц способствовало более быстрому восстановлению кровотока при индуцированной ишемии глаза, но результаты пока недостоверны. Исследована возможность определения активности карбоксилэстеразы по скорости гидролиза эналаприла в присутствии компонентов сыворотки крови. Показано, что для таких сложных систем точность определения активности невысока и данный метод не применим для подобных целей. ГКР-спектры денатурированной формы АПФ из семенной жидкости характеризовались более высокими амплитудами и более высоким соотношением сигнал/шум, чем ГКР-спектры нативного белка. Впервые получены ГКР-спектры АПФ легких, адсорбированного на серебряной подложке, и идентифицированы аминокислотные остатки белка, взаимодействующие с матрицей. Выявлены различия в ГКР-спектрах АПФ из семенной жидкости (из эпителиальных клеток) и из легких(из эндотелиальных клеток), а именно, в полосах 1183, 1270, 1613 см-1. В целях создания мукоадгезивных систем доставки лекарств были исследованы комплексы муцина из желудка свиньи с бактериолитическим ферментом лизоцимом с применением широкого спектра физико–химических методов (кинетические методы, флуоресценция, электронная микроскопия, электрофорез, хроматография). Максимально сильное связывание лизоцима с муцином из желудка свиньи наблюдалось при рН 6–7 в среде, не содержащей солей. Комплексы между биомолекулами образовывались за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженными аминогруппами лизоцима и отрицательно заряженными карбоксильными группами муцина, Ван дер Ваальсовых взаимодействий, водородных связей. Супрамолекулярные ансамбли лизоцима белка куриного яйца с муцином из желудка свиньи представляли собой полидисперсные гетерогенные микроагрегаты, на поверхности которых находились как молекулы лизоцима, так и молекулы муцина. Активность лизоцима белка куриного яйца в присутствии муцина из желудка свиньи менялась не только за счет образования комплексов, но и за счет того, что муцин вызывал увеличение вязкости среды и создавал диффузионные ограничения для доступа фермента к клеточному субстрату. На основании полученных данных можно разрабатывать стратегии получения антимикробных препаратов для мукозального применения или стратегии регуляции антимикробных свойств лизоцима, находящегося на поверхности слизистых оболочек. Комплексы лизоцима белка куриного яйца с природными биоразлагаемыми полимерами альгинатом (высокой или низкой вязкости) и хитозаном (с молекулярными массами 150 и 400 кДа) были получены при разных массовых соотношениях фермента и полимеров. Двойные комплексы лизоцим-альгинат и тройные комплексы лизоцим-альгинат-хитозан были исследованы при помощи широкого спектра физико-химических методов (спектрофотометрия, флуоресценция, электронная микроскопия, микробиология). Комплексы представляли собой микрочастицы с отрицательным зарядом и высокой эффективностью включения лизоцима. В комплексах лизоцим-альгинат-хитозан (и в этих же комплексах, стабилизированных катионами кальция) обнаружены изменения третичной структуры лизоцима (и/или полярности микроокружения остатков Trp в молекулах лизоцима). Включение лизоцима во все исследуемые комплексы происходило с сохранением активности этого фермента. В условиях длительного хранения (1.5 года при 4°С) катионы Ca++ и молекулы хитозана стабилизировали лизоцим, включенный в тройные комплексы. В физиологических условиях для микрочастиц, содержащих лизоцим, альгинат и хитозан, было характерно длительное высвобождение лизоцима и устойчивость к действию протеазы. Полученные данные важны при разработке антибактериальных препаратов на основе литических ферментов. По результатам доклинических испытаний координационные соединения меди на основе 2-алкилтиоимидазолона рекомендованы для лечения трижды негативных опухолей молочной железы. Существенным ограничением применения комплексов на практике является их гидрофобность и, как следствие, низкий уровень биодоступности. Одним из способов улучшения параметров растворимости и биодоступности гидрофобных активных молекул является их включение в “наноконтейнеры” для доставки лекарств. Для решения этой задачи была разработана методика получения липосом путем введения растворов липидов с лигандом в органическом растворителе (смеси метанола с ацетонитрилом) в водный раствор соли меди. Данный подход позволил получить суспензию, устойчивую к агрегации и седиментации до двух недель, эффективность загрузки составила порядка 1,5 %. MTT-тест (колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток) и in vitro накопление на клетках линии рака молочной железы MCF-7 показало, что формуляция имеет большую цитотоксичность в силу возросшей биодоступности. С помощью дифференциальной спектроскопии была изучена стабильность загруженных комплексов при хранении при 4оС и 37оС. С помощью флуоресцентной спектрометрии и просвечивающей электронной микроскопии была установлена точная локализация комплексов в липосомах. Выполнены исследования, направленные на создание систем дистанционного управления структурой и свойствами ферментов, иммобилизованных на магнитных наночастицах, под действием низкочастотного негреющего магнитного поля. На данном этапе в 2021 г. была разработана и оптимизирована методика синтеза бифункциональных магнитных наночастиц магнетит-золото. Магнитная компонента обеспечивает необходимые магнитные свойства, в то время как золото отвечает за иммобилизацию ферментов. Растворимость наночастиц в воде была обеспечена за счет модификации поверхности магнетита дофамином или полиэтиленгликолем. Поверхность золота была функционализирована молекулами, содержащими карбоксильную или N-триацетильную группы. На всех стадиях синтеза полученные образцы были изучены методами просвечивающей электронной микроскопии, динамического светорассеяния, анализом траектории наночастиц и ИК-спектроскопии. Синтезирован ряд стержневидных магнитных наночастиц (МНЧ), модифицированных дофамином, отличающихся между собой размером и магнитными свойствами. Дофамин служит в качестве стабилизатора частиц, а также улучшает адсорбцию МНЧ на поверхности бактериальных клеток за счет электростатических взаимодействий дофамина с фосфолипидами. Полученные частицы были применены для усиления лизиса бактериальных клеток E.coli штамма К12 под действием эндолизина Lys394 в присутствии низкочастотного переменного магнитного поля (НПМП): 50 Гц, 68,5 мТс. По итогам экспериментов были определены оптимальные параметры синтезированных МНЧ для эффективного лизиса клеток E.coli: средний размер наночастиц составил в длину 56±13 нм и в ширину 13±3 нм. Полученные МНЧ проявляют ферромагнитные свойства с коэрцитивной силой 9,6 кА/m и величиной насыщения удельного магнитного момента 15,6 emu/g. Усиление лизиса клеток под действием Lys394 в присутствии низкочастного переменного магнитного поля (НПМП) и МНЧ изучали на двух модификациях E.coli штамма К12: MH1 и JM109. Было установлено, что действие НПМП на суспензию клеток в присутствии МНЧ и Lys394 приводит к увеличению лизиса почти в два раза. В целях создания адресных систем доставки лекарств исследована аффинность к асиалогликопротеиновому рецептору (ASGPR) ряда лигандов три- и тетратерпеновой природы, хинолиновой природы. Определены значения равновесных констант диссоциации (KD) лиганд-рецепторных комплексов методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Полученные данные использовались при проведении анализа взаимосвязи «структура-функция» для дальнейшего конструирования высокоаффинных соединений-лигандов для направленной на гепатоциты доставки лекарств. Разработана методика иммобилизации низкомолекулярных соединений на золотом чипе для исследования методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Исследовано влияние ионной силы и кислотности среды на уровень иммобилизации, изучается влияние условий хранения на стабильность системы на чипе. Для оценки биораспределения химиотерапевтических соединений в опухолевой ткани был разработан платинированный углеродный наноэлектрод для электрохимического обнаружения препаратов на основе платины в различных биологических моделях, включая отдельные клетки и опухолевые сфероиды in vitro, а также внутри солидных опухолей in vivo. Продемонстрировано количественное прямое обнаружение Pt (II) в клетках аденокарциномы молочной железы MCF-7, инкубированных с цисплатином и пролекарством на основе цисплатина. С помощью разработанных наноэлектродов на положительных потенциалах возможно определение концентрации цисплатина начиная от 1 мкМ вплоть до 300 мкМ. Чтобы реализовать потенциал этого метода в моделях опухолей, измерили Pt (II) в трехмерных опухолевых сфероидах in vitro и на мышах с опухолями in vivo. Градиент концентрации Pt (II), который коррелировал с расстоянием от поверхности образца, был продемонстрирован с использованием опухолевых сфероидов MCF-7. Выполнили обнаружение Pt (II) у мышей с опухолями, которым внутривенно вводили цисплатин и пролекарство на основе цисплатина, и продемонстрировали более глубокое проникновение пролекарства по сравнению с цисплатином. Данное исследование продемонстрировало новый малоинвазивный электрохимический подход в реальном времени для изучения препаратов на основе платины. Разработаны стабильные в широком диапазоне (3,00-10,00 pH) чувствительные pH сенсоры, путем создания тонкой мембраны на конце нанокапилляра из смеси глутарового альдегида, поли-L-лизина и глюкозоксидазы. Перед in vitro и in vivo экспериментами проведена калибровка по pH в различных буферных растворах. Определены оптимальные режимы развертки напряжения. С помощью данных pH наносенсоров были изучены значения pH внутри гиппокампальных нейронов и клеток нейробластомы, а также впервые были проведены исследования по картированию поверхности клеток с целью изучения их внеклеточного pH. Изучена серия синтезированных противораковых конъюгатов на основе олеаноловой кислоты, доцетакселя, а также медных комплексов, с целью понимания механизма их действия и определения АФК, которые генерируются под действием данных веществ внутри опухолевых клеток. Было выявлено, что конъюгаты с векторами на основе N-ацетилгалактозамина к асиалогликопротеиновым рецепторам вызывают значительно больший окислительный стресс внутри клеток по сравнению со своими предшественниками. Методом последовательной двухстадийной адсорбции рН- и термочувствительного полимера, линейного полидиметиламиноэтилметакрилата (ПДМАЭМА), и фермента холиноксидазы (ХО), на графитовых поверхностях сформированы наноразмерные полимер-ферментные пленки. Выявлено влияние условий (рН и температура), при которых происходит нанесение на графитовую поверхность полимера, на электрохимические отклики полимер-ферментных сенсорных конструкций и кинетические параметры ферментативного окисления холина под действием ХО в составе полимер-ферментных пленок. Установлено, что стимулчувствительность ПДМАЭМА позволяет контролировать свойства образуемых полимерных покрытий (степень заполнения поверхности, толщину покрытия и шероховатость), которые оказывают определяющее влияние на количество связываемой ХО и, как следствие, на конечные электрохимические характеристики полимер-ферментных сенсорных конструкций. Разработан алгоритм анализа оптических изображений пленок криогелей поливинилового спирта. Алгоритм позволяет установить взаимосвязь параметров изображения и структурных и физикохимических параметров криогелей. Найдены условия, позволяющие на 2 порядка увеличить интенсивность сигнала ГКР при аналитическом использовании наночастиц серебра. Получены количественные корреляции между размерами НЧ и их электронными спектрами. Выполнено исследование сборки наночастиц серебра, меченых комплементарным ДНК зондом и молекулой-репортером, непосредственно на цепи модельных полинуклеотидов с формированием ГКР активных агрегатов. Создана новая биоаналитическая платформа регистрации АПФ методом ГКР. Проведено выделение фермента АПФ, а также исследованы методы формирования ГКР субстратов различной природы, исследованы физико-химические свойства получаемых структур. Создана автоматическая биоаналитическая платформа для одновременного экспресс-анализа четырех белков - кардиомаркеров (С-реактивный белок, цистатин-С, миоглобин и Д-димер) в плазме крови здоровых доноров и пациентов с кардиопаталогиями. Экспресс-анализ основан на методе иммуномагнитной аффинной сепарации целевых белков из образцов крови с последующим маркированием целевых белков флуоресцентными метками для каждого исследуемого белка. Предложенный метод был автоматизирован и оптимизирован для определения физиологических и патологических концентраций целевых кардиомаркеров крови. Выполнены работы по исследованию влияния среднего размера серебряных наночастиц на аналитические характеристики ГКР-методики измерения модельных аналитов, готовится к выпуску статья. Проведены работы по исследованию препаратов внеклеточных везикул методом анализа траекторий наночастиц. Методика успешно перенесена для измерения искусственных везикул – цитохалазин-индуцированных нановезикул. Разработанная новая тест-система на основе живых клеток, продуцирующих активную термостабильную люциферазу светляков использована для мониторинга двух важных внутриклеточных маркеров: АТФ (основного показателя метаболической активности клетки), и высокомолекулярной люциферазы. По изменению уровня АТР в присутствии различных внешних агентов (излучение, нагревание, добавки токсинов, антибиотиков и пр.) тест-система позволяет быстро детектировать изменения, связанные с синтезом/гидролизом АТР, а также изучать процессы, связанные с повреждением клеточной мембраны. Данная тест-система использована для изучения механизма действия антибиотиков полимиксинового ряда. Для количественного определения специфичных мРНК на биочипах предложено применить подход, распространенный в аналитической биотехнологии, но не рассматривавшийся ранее для анализа транскриптов генов - использование для построения градуировочных зависимостей стандартных образцов на основе синтетических мРНК. Данные стандартные образцы проходят все этапы анализа вместе с исследуемыми образцами транксриптов генов, что позволяет улучшить достоверность получаемых результатов по сравнению с существующими методами. Для получения синтетических образцов мРНК бета-лактамаз использовали реакцию транскрипции in vitro, позволяющую синтезировать мРНК на основе матрицы соответствующей ДНК с использованием фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы Т7. Реакция инициируется последовательностью промотора Т7 и останавливается на последовательности терминатора Т7. В качестве матриц синтеза мРНК БЛ были выбраны фрагменты плазмид штаммов E.coli – продуцентов соответствующих БЛ (ТЕМ-, CTX-M-, NDM-типов), содержащие полноразмерные гены данных БЛ с промоторными последовательностями Т7. Фрагмент плазмиды, включающий область промотора и терминатора, а также последовательность гена соответствующей БЛ, был амплифицирован в реакции ПЦР и использовался в качестве матрицы в реакции транскрипции in vitro с использованием набора реагентов для высокоэффективного синтеза РНК. В результате были получены синтетические образцы мРНК БЛ ТЕМ-1, CTX-M-116, NDM-1, которые содержали примесь ДНК-матрицы. Примесную ДНК удаляли с использованием ДНказы. Размер стандартных и исследуемых мРНК соответствует полноразмерным генам БЛ, что повышает специфичность анализа. Разработаны методки поляризационного флуоресцентного иммуноанализа на диклофенак, дегидроэпиандростерон, D-Глюкан, пестицид Бензотиостробин. Выполнены исследования, направленные на разаработку методов изотермической амплификации генов бета-лактамаз. Показано, что высокая гомология сериновых бета-лактамаз класса А является причиной низкой специфичности выявления разных бета-лактамаз, относящихся к различным генетическим субкластерам. Показано, что для повышения специфичности определения ферментов разных типов необходимо вводить дополнительные стадии их специфичной идентификации. В направлении исследований, посвященных разработке экспресс-метода определения антибиотиков в продуктах питания с использованием технологии иммунохроматографического анализа (ИХА), выполнены работы по созданию тест-систем определения антибиотика хлорамфеникола (ХАФ, левомицетин). Для контроля остаточных количеств ранее была разработана тест-система на основе латерального проточного ИХА для определения ХАФ в образцах молока. На примере проточно-инжекционного варианта анализа прокальцитонина (Пкт), являющегося маркером сепсиса, проведено сравнительное изучение возможностей снижения предела обнаружения маркера в образцах сыворотки и крови. Показано, что помимо стандартного процесса оптимизации буферного состава, рН и концентрационных условий для получения конъюгатов антител с наночастицами золота, критическим для эффективного проведения анализа является выбор возможных комбинаций антител и свойств мембранных носителей. состава компонентов тест-систем, в том числе золотых наночастиц. Установлено, что размер и форма частиц нанозолота, отличная от сферической, могут значительно влиять на чувствительность и предел обнаружения в латеральном анализе. Использование в качестве метки наночастиц золота несферической формы ("нанозвезды" и "нанопопкорн") позволяют почти на порядок снизить определяемый предел обнаружения ПКт, что позволяет проводить определение данного маркера в так называемой «серой» зоне и тем самым повысить достоверность получаемых результатов для постановки правильного диагноза. Разработаны гетерогенные хемилюминесцентные методы определения микроРНК-141, где в качестве носителей использовались магнитные микрочастицы и полистироловые планшеты. Данное исследование показало, что хотя аналитические параметры анализа одинаковые, наиболее перспективными носителями для диагностических наборов по определению микроРНК являются полистироловые планшеты, так как продолжительность анализа в этом случае существенно ниже. Выявлены особенности взаимодействия литических полисахаридмонооксигеназ (ЛПМО) из Thielavia terrestris (TtLPMO), Penicillium verruculosum (PvLPMO) и Trichoderma reesei (TrLPMO) с очищенными целлобиогидролазами (ЦБГ I и ЦБГ II), а также с эндоглюканазой II (ЭГ II) P. verruculosum при ферментативном гидролизе различных форм целлюлозы. TtLPMO является ЛПМО C1-типа, тогда как PvLPMO и TrLPMO относятся к ЛПМО смешанного C1/C4-типа в соответствии с классификацией данных оксидоредуктаз. При использовании каждой из ЛПМО в смеси с ЦБГ II или ЭГ II в процессе деструкции кристаллической или аморфной целлюлозы ферменты демонстрировали синергизм, то есть повышался выход восстанавливающих сахаров (ВС) в результате ферментативной реакции. В случае композиций PvLPMO и TrLPMO с ЦБГ I также проявлялся синергизм, однако TtLPMO, напротив, демонстрировала антагонизм с ЦБГ I по выходу ВС из целлюлозы. Предложена простая кинетическая схема, объясняющая наблюдаемые эффекты. Показано, что наиболее технологичным решением, приближенным к практическому внедрению, можно считать биоаналитические системы, использующие иммобилизованные ферменты. Установлено, что улучшение пределов обнаружения ФОС может быть достигнуто за счет использования нанообъектов вкупе с современными методами регистрации сигнала, например, с наномеханическими детекторами и преобразователями сигнала. Это сочетание технических решений обеспечивает чувствительность анализа ФОС вплоть до пг/л. При этом в качестве основных мишеней для токсичного воздействия ФОС в организме человека рассматриваются ацетилхолинэстераза (АХЭ) и целый ряд других ферментов, однако наше внимание привлек тот факт, что в этом ряду оказались не отмечены декарбоксилазы, продуктами каталитических реакций, которых являются нейромедиаторы различных процессов в организме человека, играющих важнейшую роль особенно в функционировании центральной нервной системы. Установлено, что молекулы ФОС способны связываться с декарбоксилазами независимо от того, находятся ли они в apo- or holo-форме, при этом конкурируя как с молекулой кофактора (пиридоксальфосфата), с субстратами этих ферментов, так и с молекулами известных ингибиторов данных ферментов. ФОС, малотоксичные по отношению к АХЭ, проявили себя как потенциально крайне опасные токсины во взаимодействии с декарбоксилазами. Представлено современное состояние разработок защитных материалов против биологических и химических агентов. Основное внимание уделено комбинированным системам, совмещающих в себе различные наноматериалы и биокатализаторы. Именно такое комбинирование позволяет создавать высокоэффективные универсальные защитные материалы, способные к самодетоксификации и самоочищению. Показано, что максимальным потенциалом обладают те наноматериалы и/или биокатализаторы, которые проявляют свою активность как в отношении биологических, так и химических агентов (например, как в случае фермента органофосфатгидролазы). Проведены исследования, направленные на создание способа предварительной обработки отходов с содержанием нитроцеллюлозы (НЦ) до 70–80%, при помощи щелочного гидролиза в присутствии гашеной извести (Ca(OH)2) в аэробных и микроаэрофильных условиях. Щелочной гидролиз нитроцеллюлозсодержащего осадка сточных вод (НЦСОСВ) в микроаэрофильных условиях позволяет осуществлять деградацию нитроцеллюлозы (НЦ) на 54,6% за 35 суток. При этом скорость деградации НЦ и время полураспада НЦ составило 0,023 сут-1 и 31 сутки, соответственно. Щелочной гидролиз НЦСОСВ в аэробных условиях позволяет осуществлять деградацию НЦ на 47% за 16 суток. При этом скорость деградации НЦ и время полураспада НЦ составило 0,043 сут-1 и 16 сутки, соответственно. В процессе гидролиза наблюдалось высокое накопление в жидкой фазе нитро-групп, при этом в аэробных условиях концентрация нитритов и нитратов была ниже в 3,3 и в 3,4 раза, соответственно, по сравнению с жидкой фазой в микроаэрофильных условиях. Установлено, что сообщество аборигенных микроорганизмов оказалось подвержено токсическому влиянию накопленных нитрит-ионов в растворе. В результате общая численность микроорганизмов в процессе щелочного гидролиза снизилась до 3,19*105 КОЕ/кг сух. осадка, при этом в основном выжили грибы.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа: Была показана связь между повышением продуктивной сорбции лизоцима на живыых бактериях Escherichia coli и повышением бактериолитической активности фермента против данных бактерий в присутствии добавок Gly, Glu, Asp, Lys, His и Arg. Увеличение скорости лизиса бактерий в присутствии добавок составило от 1,4 до 1,9 раза. Константа десорбции лизоцима на бактериальных клетках в присутствии добавок снижалась в 1,4–1,7 раза, что свидетельствует о более прочном связывании. Максимальная сорбционная ёмкость для лизоцима на поверхности живых бактрерий не изменялась в пределах погрешности эксперимента в разных условиях (количество лизоцима, которое максимально может связать бактериальная клетка). Наибольшие эффекты наблюдались для добавок свободных аминокислот Gly и Arg. Понимание молекулярной природы усиления антибактериального действия лизоцима в присутствии добавок актуально для разработки новых высокоэффективных антибактериальных препаратов на основе лизоцима с активирующими добавками. Впервые биолюминесцетные клетки E.coli, продуцирующие рекомбинантную термостабильную люциферазу светляков, позволяющей проводить исследования при повышенных температурах, использованы в качестве тест-систем для изучения влияния внешних стимулов на живые клетки. Разработан метод селективного определения активности люциферазы и концентрации АТФ вне и внутри клеток. Показано, что люцифераза является чувствительным белковым маркером на действие мембран-активных агентов, а АТФ – основным показателем жизнеспособности клеток. Метод использован для изучения механизма действия антибиотиков разных классов и эффективности их действия на живые клетки E.coli. Показано, что мембрано-активный антибиотик колистин не только разрушает клеточные мембраны, как считалось ранее, но и подавляет синтез АТФ, что приводит к гибели клетки. Проведена матричная сополимеризация анилина и 3-аминобензойной кислоты в ГЭР-буферной смеси на основе бетаина и глицерина с помощью лакказы. Полученные интерполиэлектролитные комплексы имеют сферическую форму диаметром 60-180 нм, электрохимически активны, обладают электропроводностью, проявляют более высокую ингибирующую способность по отношению к Staphylococcus aureus и Escherichia coli, чем гомополимеры и могут быть использованы для создания антимикробных пленочных покрытий. Было определено изменение механической жесткости нейронов и уровня АФК под действием β-амилоидного пептида. β-амилоид (Aβ) представляет собой пептид длиной 36–43 аминокислот, который под действием различных патогенных факторов способен формировать токсичные агрегаты и амилоидные бляшки в головном мозге человека и запускать патогенный каскад болезни Альцгеймера. Из всех изоформ наиболее изучен пептид Aβ длиной 42 а.о. (Aβ42), который также широко признан в качестве основной нейротоксической формы при болезни Альцгеймера. Агрегированные формы Aβ42 влияют на различные компоненты клеточной структуры, включая плазматическую мембрану и субклеточные экземпляры. Действие Aβ42 на нейрональные клетки характеризуется увеличением продукции АФК, снижением митохондриального потенциала и приводит к нарушению регуляции кальция. Ряд исследований так демонстрирует негативное влияние олигомерных и фибриллярных форм Aβ42 на цитоскелет нейронов. Цитоскелет представляет собой сеть, состоящую, в основном, из микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных филаментов. Сообщается, что Aβ42 вызывает модификации цитоскелета, такие как разборка микротрубочек и полимеризация актина, что приводит к дегенерации синапсов в нейронах. Эти эффекты приводят к изменениям механических свойств клеток, которые можно оценить с помощью техники СИПМ. С помощью техники СИПМ можно подтвердить индуцированные Aβ42 изменения жесткости и уровня АФК в нейронах гиппокампа и других клеточных культурах. Используя жесткость мембран как интегральную характеристику состояния цитоскелета в интактных клетках, можно определить, какие механизмы приводят к изменению динамики цитоскелета под действием Aβ42. Была разработана и успешно продемонстрирована возможность проведения локальных электрофизиологических измерений на примере живых клеток нейробластомы со сформированными агрегатами флуоресцентного Aβ-42. Так, разработанная технология позволяет точно определить наличие агрегата Aβ-42 путем коррелятивного картирования топографии и конфокальной визуализации. После коррелятивного сканирования производится формирование гигаОмного контакта с мембраной клетки и измерение мембранного потенциала всей клетки и сравнить с контрольными клетки, где клетки с агрегатами Aβ-42 продемонстрировали сниженный мембранный потенциал, что опять же связано с нарушением гомеостаза клетки. Разработанная методика совмещения электрофизиологических измерений и коррелятивного СИПМ позволит успешно выполнить поставленные задачи. Отработаны методики исследования фармакокинетических параметров левофлоксацина и моксифлоксацина и его модифицированных форм при внутривенном и пероральном введении в экспериментах in vivo (на крысах Wistar). Данные методики будут применены при исследовании биодоступности и фармакокинетических параметров разрабатываемых лекарственных форм фторхинолонов. Разработан и апробирован нанокапиллярный сенсор для определения концентрации кислорода внутри сфероидов и in vivo моделей опухоли. Данный сенсор позволяет неинвазивно и с высоким временным и пространственным разрешением осуществлять мониторинг содержания кислорода. В рамках апробации работы нанокапиллярного сенсора были проведены измерения внутри сфероидов MCF-7 (аденокарцинома молочной железы). Показано, что при приближении наноэлектрода к поверхности сфероида концентрация кислорода снижается, что связано с активным потреблением кислорода клетками в составе сфероида, причем было установлено, что при проникновении наноэлектродом внутрь сфероида наблюдается значительная гипоксия. Таким образом, было показано, что использование данной методики позволяет проводить измерения внутри сфероидов с высокой точностью. Следующим этапом было проведение измерений внутри in vivo моделей. Были выбраны 2 модели: мозг крысы и опухоль, имплантированная внутрь мозга крысы (глиабластома). Были измерены профили внутри мозга и опухоли крысы. Показано, что внутри глиабластомы наблюдается существенная гипоксия по сравнению с мозгом, который является активным потребителем кислорода. Это исследование указывает на потенциальную ценность такого практического подхода и предполагает, что его можно применять для изучения механизма действия и для мониторинга эффективности противоопухолевых препаратов. С целью разработки систем для тераностики онкологических заболеваний синтезированы наночастицы магнетит-золото вида "гантель", содержащие фотосенсибилизатор (ФС) (ряда бактериофеофорбида), иммобилизованный на поверхности магнетита. Разработанная методика включает в себя стабилизацию магнитной части НЧ (DOPAC и PEG) (DOPAC - 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота; PEG - полиэтиленгликоль) с дальнейшим ковалентным сшиванием с ФС. Исследованы физико-химические свойства полученных наночастиц. Гидродинамический диаметр составил 26 нм, ζ–потенциал - 17,4 мВ. Осуществлен расчет параметров системы. Квантовый выход генерации синглетного кислорода фотосенсибилизатора составил 0,79. Минимальный радиус Ферстера 51,02 Å. Разработан метод загрузки фотосенсибилизатора на поверхность магнетита путем химической конъюгации. В методике использовали три блок сополимер (PEG) и DOPAC для стабилизации системы в водной среде. Конъюгаты аторвастатина с увеличенной гидрофильностью и повышенной гепатоселективностью были синтезированы и охарактеризованы. Исследована аффинность к асиалогликопротеиновому рецептору (ASGPR) ряда лигандов – конъюгатов аторвастатина и фрагментов N-ацетилгалактозамина со сложноэфирной и амидной связями. Получены равновесные константы диссоциации (KD) лиганд-рецепторных комплексов методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Определены кинетические параметры реакции восстановления 3-гидрокси-3-метилглутарил кофермента А, катализируемой ферментом ГМГ-КоА редуктазой в присутствии конкурентного ингибитора ‒ аторвастатина. Изучен процесс высвобождения активного ингибитора из конъюгатов под воздействием кислой среды (pH 3). Было показано, что в случае коньюгатов со сложноэфирной связью реакция образования промежуточного соединения – лактона имеет псевдопервый порядок, а реакция гидролиза лактона ‒ псевдонулевой. Продемонстрировано, что коньюгаты с амидной связью являются стабильными как в кислой среде, так и в присутствии эстеразы из свиной печени. Изучена способность коньюгатов аторвастатина снижать каталитическую активность ГМГ-КоА редуктазы. Показано, что не гидролизованные коньюгаты не способны ингибировать фермент. Разработана и оптимизирована методика иммобилизации фенилацетонмонооксигензы на поверхности гибридных магнитных наночастиц (МНЧ). Метод заключается в специфическом связывании N-триацетильного мотива на поверхности наночастицы с полигистидиновым участком фермента и остатком гистидина-187, являющимся важным для каталитической активности фермента. Получение иммобилизованного белка на МНЧ было подтверждено с помощью анализа траектории наночастиц (NTA) и ИК-спектроскопии. В результате иммобилизации фермент связывается в неактивной форме. Установлено двукратное увеличение активности иммобилизованного фермента в результате воздействия магнитного поля частотой 50 Гц. Синтезированы стержневидные магнитные наночастицы (МНЧ) на основе оксидов железа. Полученные МНЧ были модифицированы дофамином и охарактеризованы Мессбаэровской спектроскопией, методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и анализом траектории наночастиц (АТН). Полученные частицы представляют собой стержневидные МНЧ, в состав которых входит магнетит (20%) и акагенит (80%). Размер частиц составил в длину 56±13 нм и в ширину 13±3 нм. Гидродинамический радиус полученных частиц составил 78±10 нм. Синтезированные МНЧ использовали для дестабилизации внешней мембраны клеток E.coli под действием низкочастотного переменного магнитного поля (НЧ ПМП) с целью усиления выхода перепилазматического белка β-лактамазы. Выход периплазматического белка оценивали спектрофотометрически, измеряя его активность в супернатанте с применением хромогенного субстрата CENTA. Установлено, что воздействие НЧ ПМП (50 Гц, 68,5 мТс) в течение 20 минут при комнатной температуре к суспензии клеток E.coli в присутствии стержневидных МНЧ приводит к усилению выхода периплазматического белка более чем в 4 раза относительно контроля. Разработан метод количественного определения специфичных мРНК бета-лактамаз разных молекулярных классов на биочипах и определены его аналитические характеристики. Разработана системы выделения и очистки рекомбинантной сериновой бета-лактамазы СТХ-М-116 молекулярного класса А; получен высокоочищенный препарат рекомбинантного фермента для иммунизации кроликов. Получены и охарактеризованы специфические к бета-лактамазе СТХ-М типа поликлональные антитела (титр 1:100000); показана возможность иммуноферментного определения бета-лактамазы СТХ-М типа в буферном растворе с использованием хромогенного субстрата CENTA. Впервые получены и проанализированы новые кристаллические структуры нативной бета-лактамазы TEM-171 и двух ее комплексов с широко используемым ингибитором тазобактамом. Установлена ингибирующая активность известного детоксицирующего антидота 2,3- димеркаптопропан-1-сульфоната (унитиола) против металло-β-лактамаз двух типов; показано, что унитиол действует как конкурентный ингибитор гидролиза меропенема рекомбинантной металло-β-лактамазой NDM-1; показано, что унитиол ингибирует природные металло-β-лактамазы NDM-1 и VIM-2, продуцируемые резистентными к карбапенемам штаммами К. pneumonia и E. сoli. По направлению «Изучение механизмов антибиотикорезистентности бактерий, обусловленной продукцией бета-лактамаз, и поиск подходов к ее преодолению» научные исследования проводились по трем основным направлениям: 1) изучение структурных особенностей бета-лактамаз разных молекулярных классов и анализ структур их комплексов с ингибиторами; 2) репозиционирование известных лекарственных препаратов для ингибирования бета-лактамаз; 3) разработка новых биохимических и молекулярно-генетических методов контроля бета-лактамаз и кодирующих их генов. В рамках данных направлений получены следующие результаты: 1) впервые получены и проанализированы новые кристаллические структуры нативной бета-лактамазы TEM-171 и двух ее комплексов с широко используемым ингибитором тазобактамом; различие в структурах двух комплексов состоит в конформации ингибитора в активном центре фермента; структуры комплексов соответствуют разным стадиям деацилирования ацил-ферментного комплекса; 2) установлена ингибирующая активность известного детоксицирующего антидота 2,3-димеркаптопропан-1-сульфоната (унитиола) против металло-β-лактамаз двух типов; показано, что унитиол действует как конкурентный ингибитор гидролиза меропенема рекомбинантной металло-β-лактамазой NDM-1; показано, что унитиол ингибирует природные металло-β-лактамазы NDM-1 и VIM-2, продуцируемые резистентными к карбапенемам штаммами К. pneumonia и E. сoli; 3) разработан метод количественного определения специфичных мРНК бета-лактамаз разных молекулярных классов на биочипах и определены его аналитические характеристики (пределы обнаружения специфичных мРНК бета-лактамаз составили от 5.0 до 7.0 пМ); диапазоны определяемых концентраций мРНК оказались близкими для всех типов исследованных генов БЛ, что важно для их одновременного определения; разработана системы выделения и очистки рекомбинантной сериновой бета-лактамазы СТХ-М-116 молекулярного класса А; получен высокоочищенный препарат рекомбинантного фермента для иммунизации кроликов; получены и охарактеризованы специфические к бета-лактамазе СТХ-М типа поликлональные антитела (титр 1:100000); показана возможность иммуноферментного определения бета-лактамазы СТХ-М типа в буферном растворе с использованием хромогенного субстрата CENTA. Проведен отбор образцов крови, плазмы, молока и волос домашних коз в полевых условиях для проведения мониторинга стрессовых состояний (определение гормона кортизола). Проведен сравнительный анализ определения кортизола в жидкой плазме и сухой крови с использованием метода иммуноферментного анализа. На модельной системе проведено изучение образования агломератов конъюгатов биотинилированных антител с наночастицами золота различных размеров и стрептавидина в зависимости от концентраций компонентов. Подход может быть использован для увеличения чувствительности латерального проточного иммуноанализа при сохранении концентрации коллоидных наночастиц в качестве метки. Синтезирован и охарактеризован метало-полимерный гибридный наноматериал на основе наночастиц серебра, ассоциированных со стимулчувствительным диблок-сополимером поли(1,2-бутадиен)-блок-поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилатом). Продемонстрировано усиление сигнала гигантского комбинационного рассеяния (ГКР сигнала) 4-меркаптофенилбороновой кислоты в присутствии металлополимерного гибридного наноматериала под действием локального лазерного облучения. Предложены механизмы, объясняющие усиление ГКР сигнала в данной системе. Продолжены работы по исследованию препаратов внеклеточных везикул методом анализа траекторий наночастиц. Методика успешно опробована для измерения везикул бактериального происхождения. Исследованы возможности методов машинного обучения для оценки степени посттрансляционной модификации белков на основе новой тандемной ГКР технологии, объединяющей высокочувствительную ГКР спектроскопию и ферментативный гидролиз белковых молекул на примере фибриногена с различной степенью окислительной модификации с использованием различных типов подложек на основе непрерывных пленок серебра. Разработаны принципы применения методов машинного обучения для анализа ГКР спектров при использовании тандемной ГКР технологии. Впервые биолюминесцетные клетки E.coli, продуцирующие рекомбинантную термостабильную люциферазу светляков, позволяющей проводить исследования при повышенных температурах, использованы в качестве тест-систем для изучения влияния внешних стимулов на живые клетки. Разработан метод селективного определения активности люциферазы и концентрации АТФ вне и внутри клеток. Показано, что люцифераза является чувствительным белковым маркером на действие мембран-активных агентов, а АТФ – основным показателем жизнеспособности клеток. Метод использован для изучения механизма действия антибиотиков разных классов и эффективности их действия на живые клетки E.coli. Показано, что мембрано-активный антибиотик колистин не только разрушает клеточные мембраны, как считалось ранее, но и подавляет синтез АТФ, что приводит к гибели клетки. Исследованы концентрационные эффекты p-сульфонато-каликс[n]аренов (СnS) на ключевые показатели системы гемостаза. Выявлено, что С4S и С6S благодаря различиям в структуре и гибкости их гидрофобного ядра и числу зарядов способны распознавать разные белки плазмы: C4S изменяет конформацию фибриногена и стимулирует его свертывание, напротив, C6S подавляет свертывание фибриногена за счет ингибирования активности тромбина и каскада свертывающих факторов. Таким образом, C4S обладает коагулянтной, а C6S –антикоагулянтной активностью. Исследовано влияние генерации полиамидоаминных (PAMAM) дендримеров (G1.5, G2.5 и G3.5) и соотношения SK:полимер (1:1 - 1:10 М/М) на тромболитическую эффективность конъюгатов SK-дендример. Найдено, что конъюгаты SK-G3.5 (1:1) и (1:5) обладают максимальной тромболитической активностью, более стабильны в плазме и вызывают меньший фибриногенолиз, чем нативная SK. Снижение стоимости тромболитической терапии при использовании недорогой и доступной в России SK. Ранее нами обнаружено наличие у онкобольных IgG, способного связываться с плазминогеном (Pg). Изучение влияния селективного протеолиза лизиновых связей IgG плазмином на связывание и активацию Pg показало, что в отличие от интактного IgG, обработанный плазмином IgG (IgG*), связывается с Pg сильнее и повышает скорость его активации урокиназой. Удаление С-концевого лизина карбоксипептидазой В или добавление L-лизина ингибирует связывание IgG* с Pg. Резюме: IgG*, в отличие от интактного IgG, способен связываться с крингл-доменами плазмин(огена). и ключевая роль в этом процессе принадлежит доступному С-концевому лизину в IgG*. Связывание циркулирующих IgG к плазминогену может быть использовано в качестве теста для выявления онкопациентов. В результате исследований анаэробной деградации НЦ получены кинетические кривые разложения осадков НЦ в зависимости от степени загрузки реактора биокатализатором, а также кривые накопления биогаза с множеством отличий, что позволило определить оптимальные условия использования биокатализаторов. Разработка системы доставки лекарственного препарата в глаз на основе неорганических кальций-фосфатных частиц, покрытых органическим полимером хитозаном, а также хитозановых частиц. Разработка аналитической платформы на основе ГКР-спектров для идентификации гликоформ ангиотензин-превращающего фермента, продуцируемого разными типами клеток. Характеристика взаимодействия АПФ с белками различной природы. Получены и охарактеризованы кальций-фосфатные частицы, покрытые хитозаном и содержащие супероксиддисмутазу, а также совместно супероксиддисмутазу и ингибитор АПФ. Получены и охарактеризованы хитозановые частицы, содержащие ингибитор АПФ. Впервые получены ГКР-спектры АПФ сердца, показаны их отличия от ГКР-спектров АПФ легких и семенной жидкости. Впервые количественно оценено взаимодействие АПФ с лизоцимом. В течение 2022 г. проводились работы по конструированию планшетных хемилюминесцентных методов анализа с применением захватывающих полимерных конъюгатов аналитов вместо использования дорогостоящих специфических антител. Получены гидрофобированные препараты декстрана, способные удерживаться на поверхности полистирола. Полученные конъюгаты гидрофобированного декстрана с флуоресцеином (модельным аналитом, используемым для определения оптимальных условий синтеза) показали перспективность такого подхода иммобилизации аналита в лунках планшета для иммуноферментного анализа. Полученные результаты являются основой (на следующем этапе работы) для развития гетерогенных методов определения нуклеиновых кислот. Соосаждением природных полимеров получены гибридные микрокристаллы ватерита. Включение биополимеров позволило изменить физико-химические характеристика частиц: поверхностный заряд, площадь, размер пор и нанокристаллитов, содержание полиморфов. Для гибридных микрокристаллов продемонстрированы: меньшая адсорбция альбумина на поверхности, сохранение активности сорбированных оксидоредуктаз, а также определены кинетические параметры иммобилизованных ферментов. Исследованы многофункциональные свойства частиц и обсуждены возможности их использования мукозальной доставки биологически активных белков и ферментов. Проведена первичная оценка гемолиза эритроцитов гибридными микрокристаллами. Полученные результаты открывают новые перспективы создания средств доставки биологически активных веществ на основе микрокристаллов ватерита с различной архитектурой, а также представляют интерес для обсуждения процессов биоменерализации солей кальция в организме при различных патологических процессах. Проведены клонирование и экспрессия полноразмерной эндо-процессивной ксилоглюканазы из гриба T.reesei (TrXeg74A), а также каталитического домена фермента (TrXeg74A-CD) в реципиентном штамме P.verruculosum B1-537, являющимся высокоэффективным продуцентом целлюлаз. Уровень секреции белка после культивирования полученных рекомбинантных штаммов в лабораторном ферментере составил 35,4 и 31,4 г/л, при этом секреция TrXeg74A составила не менее 30% от общего количества белка, тогда как TrXeg74A-CD экспрессировался в гораздо меньшей степени. Обе формы рекомбинантного фермента были выделены и изучены их свойства. TrXeg74A и TrXeg74A-CD характеризовались сходной степенью процессивности при действии на ксилоглюкан из тамаринда, близкими по значению константами Михаэлиса (0,35–0,38 г/л), сходными с таковой для нативного фермента (0,30 г/л), в то же время каталитическая константа для TrXeg74A-CD была примерно в полтора раза выше соответствующего параметра для полноразмерной ксилоглюканазы. Полученные новые рекомбинантные штаммы P. verruculosum могут быть полезными при создании композиционных ферментных препаратов для эффективного гидролиза возобновляемой растительной биомассы. Показано, что формирование искусственных микробных консорциумов и применение биокатализаторов в иммобилизованном виде лежит в основе успешной реализации гибридного химико-биокаталитического процесса обессеривания модельных сред и реального углеводородородного сырья. Описаны различные подходы к формированию иммобилизованного в криогеле поливинилового спирта искусственного консорциума в анаэробном метаногенном биореакторе с целью биотрансформации органических сульфонов в сульфид параллельно с накоплением биогаза. Показано, что искусственный анаэробный консорциум способен к биоконверсии смеси 0,15 мМ дибензотиофенсульфона и 0,15 мМ бензотиофенсульфона с выходом сульфида 98% и уровнем эффективности метаногенеза 97% за 8 сут. Гидролизат пшеничной соломы и этанол (экстракт сульфонов из процесса окислительной десульфурации бензо- и дибензотиофенов) были успешно введены в среду для метаногенеза в качестве дополнительного субстрата процесса. Продемонстрирована успешная метаногенная биотрансформация серосодержащих отходов, полученных после химического окислительного обессеривания неочищенного вакуумного газойля, прямогонной бензиновой фракции (нафта), газового конденсата, прямогонной дизельной фракции. Отходы с высоким содержанием азота (гидролизаты куриного помета) и биомасса фототрофных микроорганизмов (Chlorella vulgaris) впервые успешно применены в качестве ко-субстратов в ходе метаногенной биотрансформации серосодержащих экстрактов, полученных после химического обессеривания углеводородного сырья. Достигнута 100%-ная конверсия серы, содержащейся в экстрактах, в неорганический сульфид с одновременным получением биогаза с высоким содержанием метана (>70%). Очистку стоков из метантенка осуществляли методом DEAMOX (DEnitrifying AMmonia Oxidation). Высокая эффективность процесса достигалась с использованием оригинальных иммобилизованных искусственных консорциумов. Получены новые композиционные волокнистые материалы с антибактериальными свойствами. Показано, что введение в матрицу бактериальной целлюлозы полилактида или обычных волокон, дополнительных полимеров приводит к снижению их структурной пористости. На примере Escherichia coli и Bacillus subtilis показано, что наилучшую антибактерисльную активность проявляли композиты, в состав которых входили полигидроксибутират и наночастицы Та. На основе анализа известных данных, установлено, что функционирование биокатализаторов – продуцентов полисахаридов, можно оптимизировать с помощью следующих основных подходов синтетической биологии: использование рекомбинантных биокатализаторов, создание искусственных консорциумов, сочетание нано- и микробиокатализаторов, их иммобилизация. Новые биокатализаторы способствуют расширению спектра полезных свойств полисахаридов и направлений их применения. Изучен процесс гидролиза ряда микотоксинов (патулина, дезоксиниваленола, зеараленона и стеригматоцистина) с применением фермента His6-OPH. Наилучшие константа Михаэлиса и каталитическая константа были оценены в случае стеригматоцистина и патулина, соответственно. Исследована возможная комбинация His6-OPH с неорганическими сорбентами, обработанными низкотемпературной плазмой. Ферментно-полиэлектролитные комплексы поли(глутаминовой кислоты) с His6-OPH и другим ферментативным деструктором микотоксинов (термолизин) были успешно использованы для модификации волокнистых материалов. В ходе разработки подходов к деструкции микотоксинов оценены каталитические характеристики 7 выбранных ферментов в потенциальных реакциях с различными микотоксинами (афлатоксин В1, цитринин, дезоксиниваленол, эрготамин, фумонизин В1, глиотоксин, охратоксин А, патулин, стеригматоцистин, токсин Т-2, зеараленон) при различных значениях рН. Для стабилизации ферментов, гидролизующих микотоксины, с помощью компьютерного моделирования были подобраны специальные биополимеры. Выявлено, что полиглутаминовая кислота является универсальным партнером полиэлектролитных комплексов с выбранными ферментами. С привлечением модельных животных объектов в виде крыс Sprague-Dawley проведены эксперименты по их кормлению in vivo кормом, загрязненным смесью микотоксинов в дозах, на порядки превышающих максимально допустимые пределы. Обработка контаминированных кормов новыми комбинированными ферментными нанокомплексами значительно снижала негативное влияние смеси микотоксинов на биохимические показатели крови. Без обработки кормов у животных биохимические показатели крови свидетельствовали о значительном поражении печени и почек за счет интоксикации. Проанализированы основные направления применения биолюминесцентного метода анализа АТФ: санитарный контроль, контроль качества очищенной воды, микробный анализ в пищевой промышленности, оценка качества лекарств, а также мониторинг метаболического состояния биокатализаторов, используемых в различных биотехнологических процессах. АТФ-метрия успешно апробирована в новых направлениях: создание синтетических микробных консорциумов, их внедрение в качестве новых биокатализаторов процессов биодеградации пестицидов, подавление накопления метана на модельных городских полях, контроль опасного развития биокоррозионных процессов, разработка химико-биокаталитических гибридных процессов, создание эффективных антимикробных перевязочных и защитных тканевых материалов и др. Изучены возможности применения супрессоров метаногенеза, таких как окислительно-восстановительные производные гуминовых кислот, персульфат калия, обладающий окисляющими и электроноакцепторными свойствами, фермент гексагистидинсодержащая фосфорорганическая гидролаза с высокой лактоназной активностью и полипептидный противомикробный препарат бацитрацин. Действие этих веществ было направлено на различных участников природного метаногенного консорциума, а также на осуществляемые ими биохимические процессы. Использование персульфата калия совместно с бацитрацином обеспечивало максимальное и практически полное подавление продукции метана. Измеренная концентрация внутриклеточного аденозинтрифосфата показало, что жизнеспособность клеток в консорциуме практически не меняется, тогда как их метаболическая активность снизилась. Различные комбинации перечисленных выше супрессоров обеспечивали разную степень подавления метаногенеза, но ключевую роль во всех исследованных случаях играли окислительно-восстановительные агенты. Установлено, что иммобилизация клеток в криогель поливинилового спирта может успешно применяться для одновременной криоиммобилизации, криоконсервации и длительного хранения клеток различных фототрофных микроорганизмов (зеленых и красных микроводорослей, диатомей и цианобактерий). Впервые на 12 различных иммобилизованных клетках микроводорослей показано, что они могут храниться в замороженном виде не менее 18 месяцев с сохранением 90%-го уровня жизнеспособности, а в дальнейшем могут быть использованы в качестве для накопления биомассы в жидкой среде. Применение криоиммобилизованных клеток Chlorella vulgaris в качестве инокулята позволило загрузить в среду высокую концентрацию клеток микроводорослей для накопления свободной биомассы, что увеличило скорость процесса. Показано, что не менее 5 циклов повторного использования одних и тех же иммобилизованных клеток в качестве инокулята для накопления клеток может быть реализовано при использовании различных реальных сточных вод в качестве сред для одновременного культивирования микроводорослей и очистки воды. Разработан иммобилизованный искусственный консорциум на основе микроорганизмов, принадлежащих к грамположительным и грамотрицательным бактериальным клеткам, способных совместно осуществлять быструю и эффективную деградацию различных фосфорорганических пестицидов: параоксон, паратион, метилпаратион, диазинон, хлорпирифос, малатион, диметоат и деметон-S-метил. В качестве носителя для иммобилизации консорциума использовали криогель поливинилового спирта. После отбора между несколькими кандидатами из родов Rhodococcus и Pseudomonas была найдена необходимая комбинация из двух культур (P. esterophilus и R. ruber). Дальнейшее изменение соотношения между биомассой клеток внутри гранул иммобилизованного консорциума, увеличение плотности упаковки клеток внутри тех же гранул и уменьшение размеров гранул обеспечило улучшение активности по отношению к токсиканту на 225%. Увеличение скорости и степени деградации пестицида было в 4,5 и 16 раз выше, чем у индивидуальных клеток P. esterophilus и R. ruber, соответственно. Продемонстрировано многократное использование полученного иммобилизованного консорциума. Совместное включение природных штаммов в носитель во время иммобилизации усиливало активность консорциума без генетической модификации клеток. Проведена аннотация генома дрожжей Ogataea parapolymorpha на предмет идентификации генов оксидазы D-аминокислот.. Впервые в мире в одном геноме найдены гены пяти оксидаз D-аминокислот и одной D-аспарат оксидазы. Все гены клонированы в клетках E.coli. Проведены эксперименты по введению пяти аминокислотных замен в мутантную формиатдегидрогеназу.Каждая точечная заменаранее давала стабилизацию ФДГ дикого типа. Показано, что эти же замены дают стабилизацию и мутантной ФДГ, причем одна замена имела кооперативный положительный эффект Сконструированы новые биоинженерные форматы рекомбинантных иммуноглобулинов для профилактики и терапии коронавирусной инфекции. Разработана система экспрессии рекомбинантных моноклональных иммуноглобулинов IgA-класса для интраназальной профилактики и лечения коронавирусной инфекции. Получены образцы рекомбинантных антител, обладающих противовирусной активностью в отношении актуальных штаммов SARS-CoV-2. Оптимизированы способы получения рекомбинантных антител IgA-класса из среды культивирования клеток млекопитающих.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа: Проведено изучение стехиометрических и концентрационных зависимостей образования агломератов наночастиц золота с использованием системы биотин-стрептавидин для использования в латеральной проточном иммуноанализе. Разработан метод иммуноферментного анализа в формате иммуночипа, на основе нанесения специфических реагентов и проведения реакции в микрозонах на дне лунок полистиролового планшета, для определения антител к возбудителям инфекционных заболеваний птицы (кур), в том числе поствакцинальных антител. Латеральный проточный иммуноанализ разработан для использования при серологических исследованиях поголовья в птицеводстве. Разработан метод модификации декстрана бензиламином, а также синтез конъюгата полученного гидрофобизованного декстрана с аминосодержащим захватывающим олигонуклеотидным зондом. Показано, что использование данного конъюгата (после его сорбции на поверхности полистиролового планшета) как захватывающего зонда позволяет проводить реакцию гибридизации и тем самым выявлять олигонуклеотиды. Сверх плана был разработан оригинального гетерогенный метод определения микроРНК-155 с применением модифицированной бесферментной реакции сборки шпилек. Предел обнаружения и коэффициент вариации данного метода составили 0.4 пМ и 12%, соответственно. Сконструированный метод показал высокую специфичность в отношении аналита. Исследования направлены на применение в медицине, ветеринарии, агробиологии и медико-биологических научно-исследовательских работах. Данные отражены в кандидатских и докторских диссертациях, защищенных в 2023 г. Получены полимеры на основе циклодекстрина с использованием в качестве линкеров 1,6-гексаметилендиизоцианата, янтарного ангидрида и лимонной кислоты. Полимеры на основе циклодекстрина образуют устойчивые комплексы с фторхинолонами, цефалоспоринами и пенициллинами. Формирование комплексов полимер-лекарство увеличивает эффективность связывания препаратов с человеческим сывороточным альбумином. Комплексы показали выраженную антибактериальную активность на грамположительных и грамотрицательных штаммах бактерий. Полученные результаты необходимы для развития фундаментальных представлений о системах доставки лекарственных препаратов, а также в медицинской биотехнологии для разработки высокоэффективных лекарственных форм препаратов с использованием биосовместимых нетоксичных носителей на основе циклодекстринов. Исследована возможность использования гидрогелей полиметилсилсесквиоксана с вариабельным содержанием неорганических сшивок. Обнаружено, что при сорбции для хлорида железа (III) нет существенной разницы в сорбции в гидрогелях разной структуры, и на микрофотографиях СЭМ/ЭРС наблюдается равномерное распределение атомов железа по матрице носителя. Для терапевтически значимого D-глюконата железа (II) наблюдается влияние структуры гидрогеля на сорбцию и распределение железа по носителю. Полученные результаты открывают возможности дальнейшего тонкого дизайна системы доставки соединений железа с улучшенными биофармацевтическими свойствами. Разработана методика функционализации поверхности гибридных магнитных наночастиц магнетит-золото со структурой гантель. Полученные результаты могут быть использованы для создания систем удаленного регулирования активности иммобилизованных ферментов для целей биотехнологии и медицины. В частности, разработанные магнитные носители могут быть полезны при разработке лекарственных препаратов направленного действия и контролируемого высвобождения лекарственных веществ под действием низкочастотного магнитного поля. Получены материалы, содержащие фермент лизоцим и низкомолекулярный антибиотик – пептидной и непептидной природы. Охарактеризовано влияние указанных соединений на структуру лизоцима. Исследована эффективность действия полученных материалов на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Построены модели структур на основе лизоцима и низкомолекулярного антимикробного агента. Полученные результаты могут быть применены в медицине и ветеринарии для лечения различных инфекционных заболеваний. Также полученные результаты могут быть использованы для разработки наборов для выделения ДНК и других компонентов из клеток. Синтезирован ряд производных биосовместимого полимера на основе N-гидроксипропилметакриламида, была изучена их способность селективно связываться с рядом модельных структур различной природы (адренорфин, охратоксин А, асиалогликопротеиновый рецептор). Были отобраны наиболее перспективные соединения-кандидаты, способность селективно связываться с мишенями была подтверждена в присутствии белков сыворотки крови. Получены конъюгаты доцетаксела и аторвастатина с фрагментом N-ацетилгалактозамина с различной длиной линкера между нацеливающим фрагментом и основной частью молекулы. Получен конъюгат доцетаксела с тривалентным лигандом с тремя остатками GalNAc. Способность полученных конъюгатов связываться с рецептором была охарактеризована методом молекулярной динамики и с помощью спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Была изучена аффинность к асиалогликопротеиновому рецептору ряда лигандов три- и тетратерпеновой природы, хинолиновой природы. Полученные данные использовались для анализа взаимосвязи «структура-функция» для дальнейшего конструирования высокоаффинных соединений-лигандов для направленной на гепатоциты доставки лекарств. В результате была отработана технология отбора высокоаффинных лигандов. Была отработана методика создания производных биосовместимого полимера на основе N-гидроксипропилметакриламида для селективного связывания ряда модельных соединений. Результаты исследования имеют возможность практического использования в экономике и социальной сфере как рабочая технология для определения аффинных молекул к необходимым токсичным ксенобиотикам и другим молекулам. Также результаты могут быть использованы при создании платформ для направленной доставки лекарств в гепатоциты. В результате проведенной работы были сделаны следующие выводы: совместного термического разложения пентакарбонила железа и тетрахлораурата водорода позволяет получать гибридные НЧ магнетит-золото размером Fe3O4 (11,0 ± 1,5) нм и Au (4 ± 1) нм, стабилизированные олеиновой кислотой; исследование магнитостатических свойств димерных наночастиц Fe3O4-Au показало, что данные наночастицы являются суперпарамагнетиками, значения намагниченности насыщения и коэрцитивной силы составили (62,3±2,0) э.м.е./г и (14 ± 2) мТл, соответственно, что подтверждает преобладающую магнитную фазу магнетита; произведен подбор FRET-пары ФФ/ФС и изучены оптические свойства, что позволило убедиться в оптимально подобранных спектральных характеристиках; было проведено исследование распределения стабилизированных DOPAC и ПЭГ наночастиц Fe3O4-Au по размерам и измерение их ζ-потенциала, которые составили (25 ± 5) нм и -18 мВ, соответственно, что является приемлемым для дальнейших исследований in vitro и in vivo; модификация НЧ DOPAC и ПЭГ с последующей активацией EDC/NHS позволяет осуществить эффективное присоединение ФС на магнитную поверхность НЧ; использование NHS-эфира производного ФФ позволяет обеспечить ковалентную конъюгацию с поверхностью золота; было проведено исследование спектральных характеристик платформ Fe3O4-Au/ФС, Fe3O4-Au/ФФ и Fe3O4-Au/ФС/ФФ. При изучении оптических свойств платформ с ковалентной конъюгацией ФС и ФФ, зарегистрированные спектры поглощения показали такие же максимумы поглощения, что и для растворов с чистыми ФС и ФФ, что подтверждает эффективную конъюгацию на поверхность наночастиц; эффективность систем Fe3O4-Au/ФС, Fe3O4-Au/ФФ и Fe3O4-Au/ФС/ФФ продемонстрирована исследованиями in vitro. Данную бифункциональную платформу планируется применять для проведения тераностики онкологических заболеваний. Проведен анализ современного состояния применения ГЭР для биотехнологических целей. Подобраны компоненты ГЭР и их молярные соотношения для дальнейшего использования в ферментативном синтезе и в процессах предобработки растительного сырья. Полученные новые данные о глубоких эвтектических растворителях (ГЭР) могут быть широко использованы для целей биотехнологии. Обладая рядом преимуществ по сравнению с традиционными органическими растворителями, ГЭР исключительно полезны при проведении процессов, отвечающих требованиям «зеленой химии», Особенно важно, что применение ГЭР принципиально расширяет возможности получения продуктов с новыми свойствами. ГЭР могут служить средой для проведения биохимических реакций между соединениями с плохой растворимостью в водных растворах, ГЭР успешно используются для экстракции физиологически активных веществ, предобработки растительного сырья, для получения биопластиков и других процессов. Разработаны иммунные методы определения низкомолекулярных лекарств в продуктах питания, микотоксинов и фталатов в водах открытых водоемов. Разработан поляризационный флуоресцентный анализ определения эритромицина в молоке, с применением моноклональных антител показана возможность определения окадаевой кислоты в водах открытых водоемов, с помощью иммунных методов анализа показана возможность определения веществ, способных разрушать эндокринную систему человека: фталаты, бисфенол А, нонилфенол. С применением однодоменных антител верблюда разработан поляризационный анализ определения лактоферрина в молоке и трансферрина в плазме крови и моче человека. Данные разработки могут применяться в ветеринарии, пищевых производствах и медицинских центрах. Соосаждение биополимеров в кристаллы карбоната кальция изменяет физико-химические и биологические свойства и влияет на включение биологически активных веществ. Получены гибридные микрокристаллы ватерита с природными полисахаридами декстрансульфатом, ходроитинсульфатом, гепарином, фукоиданом и пектином. Для гибридных микрокристаллов с полисахаридами установлена зависимость морфологии и заряда поверхности от природы использованных полисахаридов. Антиоксидантная активность выявлена у гибридных микрокристаллов с фукоиданом и гепарином. Поверхностный заряд и размер пор гибридных микрокристаллов влияли на сорбцию анионных (каталазы) и катионных (лактоферрин) белков, гликопротеина муцина, а также на жизнеспособность эритроцитов и клеток, родственных эпителию кишечника. Для каталазы, сорбированной на гибридных микрокристаллах, наблюдалось уменьшение каталитической константы и константы Михаэлиса по сравнению с нативным ферментом. На основании сопоставления свойств сделаны выводы о характере комбинированного действия гибридных микрокристаллов ватерита, эффектах капсулирования белков, выбраны пектин и фукоидан, как наиболее перспективные полисахариды для использования в качестве системы мукозальной доставки белков. Включение терапевтически важных белков и ферментов в гибридные микрокристаллы ватерита с доступными полисахаридами является важным для создания новых средств доставки лекарственных веществ через слизистые поверхности. Защищена докторская диссертация Балабушевич Н.Г. «Микрокапсулирование белков с использованием наноструктурировенных матриц и послойной адсорбции полиэлектролитов». Исследованы двойные и тройные смеси свободных заряженных аминокислот и глицина как потенциальных активаторов лизоцима. Показано, что значительная активация куриного лизоцима происходит при добавлении тройной смеси гистидин – лизин – аргинин. Показано, что значительная активация человеческого лизоцима происходит при добавлении тройной смеси гистидин – глутамат – аргинин. Показано, что свободные заряженные аминокислоты и глицин улучшают продуктивную сорбцию лизоцима на бактериальных клетках. Разработка новых высокоэффективных лекарственных средств на основе лизоцима для борьбы с бактериальной инфекцией. По теме «Изучение механизмов антибиотикорезистентности бактерий, обусловленной продукцией бета-лактамаз, и поиск подходов к ее преодолению» научные исследования проводились по двум основным направлениям: 1) изучение комплексов сериновых бета-лактамаз с эффекторами методами ферментативной кинетики и физико-химическими методами; 2) определение специфичных мРНК генов бета-лактамаз лабораторных штаммов, культивированных в присутствии антибиотиков. В рамках данных направлений получены следующие результаты: проведен сравнительный анализ существующих структур бета-лактамаз в комплексе с тазобактамом по открытым данным в базе данных PDB. По результатам анализа выявлено структурное несоответствие положения интермедиата тазобактама в активном центре бета-лактамаз SHV и GES-типов со средним отличием по RMSD в 5.5 А; проведен сравнительный анализ двух кристаллических структур комплекса бета-лактамазы ТЕМ-171 с тазобактамом и выявлено различие в пространственном положении интермедиатов; определены значения констант диссоциации комплекса бета-лактамазы ТЕМ-171 с тазобактамом и разрушения стекинг-взаимодействия в растворе, составившие (2.9±0.4) с-1 и (3.4±0.3) с-1 соответственно; метод количественного анализа мРНК на биочипах в планшетах использован для количественного индивидуального определения мРНК генов бета-лактамаз четырех типов в различных смесях. Полученные результаты могут быть использованы для рационального дизайна новых ингибиторов бета-лактамаз, их использование в комбинации с бета-лактамными антибиотикамио будет способствовать повышению эффективности антибактериальной терапии. Разработанные биочипы для количественного определения мРНК генов бета-лактамаз могут быть использованы для изучения механизмов устойчивости бактерий к бета-лактамным антибиотикам и контроля экспрессируемых бета-лактамаз мультирезистентными к антибиотикам штаммами. Биолюминесцентная тест-система на основе живых клеток E.coli, продуцирующпя термостабильную люциферазу светляков Luciola mingrelica, использована для изучения эффективности действия и сравнения механизмов действия антибактериальных агентов разных классов - аминогликозидов на примере гентамицина и антибактериального агента диоксидина. Изучена кинетика изменения концентрации АТР и люциферазы внутри и вне клеток, позволяющая оценить изменение жизнеспособности клетки, степень повреждения клеточной мембраны и влияние на АТР-зависимые процессы. Показано, что в присутствии диоксидина снижение жизнеспособности клетки и ее гибель (ATPin = 0 уже через 180 мин инкубации при 37С) происходит, в основном, за счет увеличения проницаемости клеточной мембраны, в то время как гентамицин оказывает на мембрану незначительное повреждающее действие, при этом клетка сохраняет жизнеспособность несколько часов, о чем свидетельствует высокий уровень остаточного ATPin. Изучена эффективность действия и проведено сравнение сравнения механизмов действия антибактериальных агентов разных классов – полимиксинов, аминогликозидов (на примере гентамицина) и антибактериального агента диоксидина. Разработанный биолюминесцентный метод на основе живых клеток метод весьма перспективен для быстрой оценки эффективности их действия новых лекарственных средств, в том числе антибиотиков и их композиций, при создании новых лекарственных форм, при проведении скрининга новых антибактериальных агентов. Отобраны и описаны наиболее перспективные ферменты, используемые для получения антибактериальных материалов, а именно представители гидролаз и оксидоредуктаз. С применением компьютерного моделирования и экспериментальной практики изучен потенциал комбинированных антимикробных препаратов на основе сочетания производных лактоферрина и ферментов, гидролизующих лактонсодержащие QS-молекулы, гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы (His6-OPH) и пенициллин ацилазы. Получены самоорганизующиеся нанокомплексы на основе ферментов и полипептидов, которые значительно улучшают антибактериальную активность колистина. Показано, что применение различных материалов-носителей (металлоорганических каркасов, полипептидов, бактериальной целлюлозы, полигидроксибутирата, сукцинилированного желатина и др.) для иммобилизации и стабилизации фермента His6-OPH различными методами позволяет создавать новые биокатализаторы с различными свойствами и потенциалом использования. Биомасса водорослей в смесях с отработанным иммобилизованным мицелием различных грибов впервые успешно использована для биоконверсии в полигидроксиалканоаты под действием клеток Cupriavidus necator в качестве биокатализаторов. Получены новые данные относительно влияния перфторуглеродных соединений на скорость роста микроводосрослей, которые позволяют, с одной стороны, прогнозировать рост микроводорослей в условиях окружающей среды в средах с загрязнением перфоторуглеродными соединениями, а с другой стороны, разрабатывать подходы к регулированию роста фототрофных микроорганизмов с целью получения и использования высоких выходов их биомассы для последующего применения в различных областях. Обобщен и сформулирован перечень потенциальных фармацевтических загрязнителей водных сред, которые могут быть подвержены биокаталитической, в том числе гибридной, трансформации с использованием биологических катализаторов (ферментов и клеток): антибиотики, гормоны, галогенсодержащие фармацевтические препараты, нестероидные противовоспалительные препараты, анальгетики и противоэпилептические препараты. Обобщены новейшие достижения в разработке наноструктурированных катализаторов, которые могут быть использованы для устранения поллютантов углеводородной природы (полиароматические углеводороды, фенолы и др.) и очистки сточных вод нефтеперерабатывающих заводов, нефтепромысловых вод, биотрансформации серосодержащих экстрактов предварительно окисленной нефти и нефтяных фракций, и др. Обобщен анализ последних результатов по разрушению микотоксинов под действием ферментов, присутствующих в клетках анаэробных консорциумов, катализирующих метаногенез отходов. Щелочная обработка экскрементов птицы перед переработкой в метантенке предложена в качестве подхода к повышению эффективности анаэробной биотрансформации птичьего помета, содержащего микотоксины, для улучшения функционирования анаэробных искусственных консорциумов при детоксикации микотоксинов. Систематизирована информация и критически обсуждены возможные пути решения актуальных проблем, связанных с загрязнением окружающей среды микропластиками с применением химического и биокатализа. Изучена деградация отходов с содержанием нитроцеллюлозы около 75% и влажностью 80% в строго анаэробных условиях при различных температурных условиях. Стимуляция дополнительным источником биогенных элементов и развитие аборигенной микрофлоры позволило снизить концентрацию нитроцеллюлозы на 44% за 100 суток в анаэробных условиях и температуре процесса 35°C. Разработанные подходы к получению полигидроскиалканоатов, а также к регулированию роста микроводорослей в присутствии перфторуглеродов, предназначены для реализации в экоориентированных технологических процессах, связанных с получением биоразлагаемых упаковочных материалов, а также в биотехнологических процессах с замкнутым циклом, связанных с использованием микроводорослей и микроскопических грибов в качестве биокатализаторов. Самоорганизующиеся нанокомплексы на основе ферментов и полипептидов обладают потенциалом для получения новых препаратов с высокой антимикробной активностью. Комбинированные химико-биокаталитические подходы предназначены для реализации в процессах, связанных с очисткой водных сред от фармацевтических загрязнителей, микропластиков, токсичных углеводородов (очистки отходов нефтеперерабатывающих заводов, нефтепромысловых вод), а также в экологически безопасном птицеводстве. Разработанный подход к переработке отходов нитроцеллюлозы в анаэробных условиях предназначен реализации на предприятиях, связанных с производством нитроцеллюлозы. Получены и охарактеризованы кальций-фосфатные наночастицы, покрытые хитозаном и содержащие одновременно фермент супероксиддисмутазу и низкомолекулярный ингибитор ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). Охарактеризованы ГКР-спектры очищенного АПФ в присутствии АПФ-содержащей фракции плазмы крови. Количественно охарактеризовано комплексообразование АПФ с иммобилизованным лизоцимом. Начата работа по фенотипированию АПФ в ЭДТА-плазме пациентов с мутациями АПФ. Показана возможность исчерпывающего ферментативного гидролиза полубеленой сульфатной лиственной целлюлозы (полуфабриката целлюлозно-бумажного производства) при ее сверхвысоких концентрациях в реакционной смеси. Для гидролиза использованы российские коммерческие ферментные препараты; наилучшим из них оказался Агроксил Плюс, обладающий высокой активностью целлюлаз и эндоксиланазы. С помощью Агроксил Плюс в присутствии вспомогательного ферментного препарата β-глюкозидазы при исходной концентрации полубеленой целлюлозы 300 г/л было получено 290 г/л сахаров (в том числе 210 г/л глюкозы, 30 г/л ксилозы). Благодаря методу дробного внесения субстрата удалось в два раза снизить дозировку Агроксил Плюс с сохранением высокого выхода продуктов гидролиза – 270 г/л сахаров (в том числе 200 г/л глюкозы, 30 г/л ксилозы). Оптимизирован процесс получения С6 и С5 сахаров из промышленного вида целлюлозосодержащего сырья (полубеленой лиственной целллюлозы) с помощью российских промышленных ферментных препаратов целлюлаз и ксиланаз, что может быть использовано при создании промышленных процессов получения сахаров, спиртов (биотоплива), органических кислот и других полезных продуктов. Разработан новый подход к модификации поверхности, состоящий в адсорбции микрогель-ферментных комплексов, предварительно сформированных в водном растворе. Микрогель-ферментные комплексы формировали путем электростатического взаимодействия противоположно заряженных компонентов: катионного поли(N-изопропилакриламид-со-N-(3-диметиламинопропил)метакрил-амидного микрогеля и модельного фермента глюкозооксидазы. Методом пьезоэлектрического микровзвешивания с мониторингом диссипации и атомно-силовой микроскопии подтверждено образование пленок. Методом амперометрии исследованы ферментативные отклики глюкозооксидазы в составе адсорбированных на поверхность электродов микрогель-ферментных комплексов. Изучена устойчивость микрогель-ферментных покрытий к воздействию рН и соли и показана возможность частичного выделения фермента при таком воздействии. Разработан новый подход к модификации поверхности, состоящий в адсорбции микрогель-ферментных комплексов, предварительно сформированных в водном растворе. Микрогель-ферментные комплексы формировали путем электростатического взаимодействия противоположно заряженных компонентов: катионного поли(N-изопропилакриламид-со-N-(3-диметиламинопропил)метакриламидного микрогеля и модельного фермента глюкозооксидазы. Методом пьезоэлектрического микровзвешивания с мониторингом диссипации и атомно-силовой микроскопии подтверждено образования пленок. Методом амперометрии исследованы ферментативные отклики глюкозооксидазы в составе адсорбированных на поверхность электродов микрогель-ферментных комплексов. Изучена устойчивость микрогель-ферментных покрытий к воздействию рН и соли и показана возможность частичного выделения фермента при таком воздействии. Показано, что выделенные препараты внутриклеточных везикул (ВВ) достоверно могут быть охарактеризованы методом анализа траекторий наночастиц, начиная с концентрации около 5×109 частиц/мл, что накладывает ограничение на минимальное количество материала, используемое для очистки. Кроме того, продолжены рутинные работы по характеризации ВВ для различных научных групп с использованием методических наработок прошлых лет. С практической точки зрения возможным перспективным применением результатов проекта является создание нового поколения высокочувствительных биосенсорных систем для применения в области медицинской диагностики и экологического мониторинга.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа: В ходе выполнения НИР в 2024 г. были получены следующие основные результаты: Проведены исследования, направленные на создание функциональных бионаносистем для диагностики и терапии на основе белков, ферментов, антибиотиков, полимеров, физиологически активных веществ, металлических наночастиц, нуклеиновых кислот. Разработан метод стабилизации интерполиэлектролитных комплексов терапевтического фермента супероксиддисмутазы (СОД) и катионного блок-сополимера состава полиэтиленгликоль-поли-L-лизин путем введения ковалентных сшивок с использованием сшивающего агента биссульфосукцинимидил суберата. Включение СОД в интерполиэлетролитные комплексы позволяет увеличить стабильность и время полувыведения фермента. С целью создания систем дистанционного управления биомакромолекулами с разработана методика иммобилизации химотрипсина на поверхности гибридных магнитных наночастиц магнетит-золото со структурой гантель. Полученный конъюгат охарактеризован методами динамического светорассеяния, NTA и TEM. Разработанная методика позволяет синтезировать препараты иммобилизованного на магнитных наночастицах химотрипсина, стабильные в водных растворах. Предложен эффективный способ доставки нуклеиновых кислот в клетки с использованием катионных блок-сополимеров на основе модифицированного полиаспартамида для генной терапии. С целью создания новых форм антибактериальных препаратов пролонгированного действия для лечения инфекционных заболеваний легких предложена инкапсуляция антибактериальных молекул различных классов в полимерную матрицу носителя разнообразной супрамолекулярной архитектуры. Получены гидрогели на основе поливинилового спирта, циклодекстрина и карбоксиметиллцеллюлозы с инкапсулированными антибактериальными препаратами различных классов. Разработан способ определения фторхинолонов в присутствии сывороточных альбуминов и в сыворотке крови с помощью методов флуоресцентной и ИК спектроскопии. Оптимизирована система комбинированной доставки противотуберкулезных препаратов левофлоксацина и рифампицина на основе комплексов липосом с функционализированным хитозаном для лечения микобактериозов. Исследования показали высокую эффективность загрузки и стабильность полученных комплексов при ресуспендировании после лиофилизации. Оптимизировано получение многофункциональных гибридных микрокристаллов ватерита с полисахаридами фукоиданом или пектином с включением терапевтически важных белков лактоферрина и каталазы. Проведена всестороння характеризация физико-химических свойств, содержания компонентов и активности иммобилизованной каталазы в комплексных микрокристаллах перспективных для мукозальной доставки. С целью получения стабилизированных мультиферментных клеточных биосистем для применения в процессах трансформации экополлютантов при проведении гибридных каталитических (химических и биохимических) процессов» проведены анализ и систематизация данных по вариантам комбинирования биокатализаторов (ферментов и микробных клеток) с металлическими катализаторами. Установлено, что комбинирование химических и биокаталитических стадий в различных процессах является перспективным подходом к решению задач по очистке водных сред и почв от химических загрязнителей разного строения, в том числе полимеров. В результате комбинирования щелочной обработки и последующей биотрансформации полученных сред с применением грибного биокатализатора в виде клеток Aspergillus niger за 27 суток было достигнуто полное разложение образцов поликапролактона. Предложен и реализован гибридный химико-биокаталитический подход к регенерации отработанного кизельгура с пищевого производства. В ходе реализации процесса регенерации достигнут баланс между экологической безопасностью и экономической эффективностью. Разработан подход к получению в мезофильных условиях биогаза с высоким содержанием метана (69-72%) из отходов коммерческих сухих и влажных кормов для собак и кошек. За 27-28 суток в анаэробных условиях степень биотрансформации отходов составила 60-88%. Предложено техническое решение по биотрансформации спиртовой барды с получением биогаза, которое позволяет полностью отказаться от расхода артезианской воды и при этом достичь эффективности снижения ХПК перерабатываемой спиртовой барды на уровне 75–85 %. Исследовано влияние целлюлолитического биокатализатора на интенсификацию аэробных процессов деградации нитроцеллюлозы в процессе жидкофазной и твердофазной ферментации. В результате применения двухстадийной технологии было достигнуто высокое освобождение осадков от нитроцеллюлозы, не менее чем на 65 % от начального содержания. При варьировании состава сред в периодическом режиме продемонстрирована возможность использования иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopusoryzae для получения комплекса гидролитических ферментов. Оптимальное соотношение ферментативных активностей (липазная : амилазная : протеазная - 67:33:1) для разработки коммерческого ферментного препарата получено в среде с добавлением маргарина и картофельного крахмала в качестве индукторов. Фототрофные микроорганизмы (Chlorella vulgaris), полученные с использованием иммобилизованного инокулята, в сочетании с щелочным гидролизатом куриного помета и клетками Rhodococcus erythropolis были успешно апробированы в процессе очистки почв от углеводородов нефти. Проведен анализ основных современных направлений разработки средств ферментативной детоксификации биотоксинов пептидной природы. Применение гидролитических ферментов предложено для детоксификации пептидных биотоксинов в качестве альтернативы иммунобиологическим препаратам. На основе различных технических ферментных препаратов целлюлаз и ксиланаз, выпускаемых отечественной промышленностью (завод «Агрофермент») создана оптимальная мультиферментная композиция для максимально эффективного процесса осахаривания возобновляемого целлюлозосодержащего сырья (предобработанных стеблей мискантуса) и достигнут высокий выход С6 и С5 сахаров. В рамках проведения исследований, направленных на создание сенсорных материалов, биосенсоров и биоаналитических систем, получены покрытия из термочувствительного микрогеля на основе поли(N-изопропилакриламида) и фермента глюкозоокидазы. Методом атомно-силовой микроскопии изучено влияние температуры, как фактора, который определяет состояние микрогелевой матрицы, на топографические свойства микрогелевых и микрогель-ферментных покрытий. Подтверждена работоспособность оптимизированной схемы электрохимической детекции транскриптов и белков маркеров, в лабораторных условиях. Изготовлен и испытан макет (лабораторный прототип) устройства. Проведено исследование возможностей оптических систем на основе гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) для биоаналитических целей. Разработан подход комплексной характеризации коллоидных растворов серебряных наночастиц, применяемых для целей ГКР-биоанализа, с использованием методов атомно-силовой микроскопии (АСМ) и анализа траекторий наночастиц (NTA). Разработан новый метод амплификации, названный «каталитическая сборка шпилек с высвобождением олигонуклеотида». На его основе сконструирован оригинальный гетерогенный чувствительный анализ микроРНК-155 с пределом обнаружения 400 фМ. Коэффициент вариации составил менее 12 %. Разработан метод поляризации флуоресценции (FP) обнаружения бруцеллеза у коров с применением синтетических флуоресцентно меченных олигосахаридов. Используя хитиназную активность лизоцима был разработан новый субстрат пентасахарид с флуоресцентной меткой, который позволяет быстро определять активность фермента методом флуоресцентного поляризационного анализа (FPA). Применяя моноклональные и поликлональные антитела, разработан FP иммуноанализ (FPIA) определения низкомолекулярных токсикантов (дибутилфталата, тилозина, афлатоксина) с низкими пределами обнаружения в различных образцах. В качестве новых меток для использования в латеральном проточном иммуноанализе предложены наночастицы берлинской лазури. Изучено применение наночастиц берлинской лазури в латеральном проточногм иммуноанализе для каскадного усиления сигнала за счет использования колориметрического субстрата. Разработаны научно-методические основы проточного варианта иммуноанализа для определения антител птицы (кур) к возбудителям инфекционных заболеваний на основе градиентного иммуноанализа. С целью создания биолюминесцентных тест-систем на основе живых клеток, продуцирующих термостабильную люциферазу светляков L. mingrelica, для изучения кинетики действия на них внешних стимулов, проведено сравнение эффективности действия аминогликозидов (гентамицина, канамицина и неомицина) на клетки E.coli, продуцирующие различные мутантные формы люциферазы светляков (TS и GTS), по кинетике изменения концентрации АТР и люциферазы внутри и вне клеток (время анализа 4 ч). Показано, что метод позволяет проводить ранжирование по эффективности действия антибиотиков даже среди представителей одного класса. Получены и охарактеризованы кальций-фосфатные наночастицы, покрытые хитозаном и содержащие одновременно фермент супероксиддисмутазу 1 и низкомолекулярный ингибитор ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). Продемонстрировано пролонгированное и эффективное снижение внутриглазного давления у лабораторных животных под действием полученных наноформуляций. Охарактеризованы спектры гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) сыворотки крови, содержащей АПФ. Показано, что лизоцим не влияет на активность АПФ, но влияет на связывание некоторых моноклональных антител (мАт) с АПФ. Проведено фенотипирование ряда образцов ЭДТА-плазмы крови, содержащей мутированный АПФ и выявлены мутации, критичные для активности фермента и уровня его в крови. Результаты исследований значимых мутаций АПФ в крови пациентов могут быть использованы для разработки методик определения различных заболеваний и рисков их развития, в частности болезни Альцгеймера. Разработаны методы анализа содержания общего белка и активного лизоцима в различных продуктах питания с учётом особенностей пробоподготовки. Результаты исследований могут быть востребованы для простого и быстрого контроля качества препаратов, выпускаемых для пищевой промышленности. Исследовано влияние компонента косметических средств додецилсульфата натрия (SDS), или лаурилсульфата натрия, на антибактериальную активность лизоцима. Найдены концентрации SDS, при которых ингибируется 50% активности лизоцима (IC50).
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа:
8 1 января 2028 г.-31 декабря 2028 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".