ИСТИНА

LpD, или Дигидролипоамиддегидрогеназа, - это фермент, который входит в состав пируватдегидрогненазного и некоторых других мультиферментных комплексов. LpD (субъединица E2 пируватдегидрогеназы) катализирует реакцию окисления дигидролипоамида с образованием липоамида. При этом FAD восстанавливается до FADH2, и для его обратного окисления необходим второй субстрат - NAD+. Кристаллическая структура для LpD из E coli известна для апоформы (разрешение 2,5 Å). Для детального описания каталитического механизма и взаимодействия LpD с белковыми партнерами необходимо получить структуры его комплексов с субстратами - липоамидом и/или NADH, а также повысить разрешение. В рамках данного исследования оптимизирована методика получения и очистки LpD из E. coli, наработаны препаративные количества белка и его комплекса с NAD/NADH. Проведен скрининг условий кристаллизации комплекса LpD с NAD/NADH, в том числе методом встречной диффузии в капиллярах для использования в условиях микрогравитации (для эксперимента на МКС). Проведение эксперимента в условиях микрогравитации (на МКС) позволит получить структуру LpD с более высоким разрешением и детально описать каталитический механизм.

LpD, or dihydrolipoamide dehydrogenase, is an protein subunit of pyruvate dehydrogenase and some other multi enzyme complexes. LpD as an E2 part of pyruvate dehydrogenase catalyzes the reaction of dihydrolipoamide oxydation to lipoamide. In the course of this reaction, cofactor FAD is reduced to FADH2 so that the second substrate, NAD+, is necessary for its oxydation back to the active form. A crystal structure of LpD from E.coli is available for the apo-enzyme (resolution 2.5 Å). Crystal structures of apo-LpD solved with higher resolution, and of LpD complexed with substrates - lipoamide and/or NADH - are needed for the detailed description of a catalytic mechanism and its interaction with the protein partners. In this work, the protocol of isolation and purification of LpD from E.coli was optimized, which allowed the large-scale expression of a target protein and its complex with NAD/NADH. The crystallization conditions were screened of LPD complexed with NAD/NADH, including the conditions suitable for being used at the International Space Station (ISS). The principal goal of the experiment being held out at the ISS is to solve the structure of LpD with higher resolution and to describe the catalytic mechanism in detail.

Планировалась наработка препаративного количества очищенного LpD и скрининг условий его кристаллизации в комплексе с NAD+/ NADH. Планировалось, что наработанные белки будут удовлетворять следующим условиям: - получены с использованием коммерчески доступных реагентов; - очищены от белковых и низкомолекулярных примесей до чистоты не менее 98% по данным SDS-электрофореза и/или масс-спектрометрии; - очищены в лабораторных условиях с использованием хроматографических методов без использования приборов HPLC или FPLC; - препараты целевого белка будут получены в виде растворов с концентрацией не ниже 1 мг/мл с последующей возможностью концентрирования до концентрации не ниже 15 мг/мл. Планировалось, что разработанные по результатам СЧ ОКР условия кристаллизации дигидролипоамиддегидрогеназы из E.coli позволят получать кристаллы, пригодные для РСА.

Ранее в нашей работе была получена генно-инженерная конструкция для получения целевого белка, а также разработана аналитическая методика его выделения, очистки и получения в апоформе и в комплексе с одним из кофакторов, NAD+ (NADH).

В результате работы был наработан и очищен препарат LpD и его комплекса с NAD/NADH, удовлетворяющий вышеперечисленным требованиям. Чистота полученного образца по данным SDS-электрофореза составляла не менее 98%. Белок содержит кофактор FAD, но не содержит NAD. Был проведен скрининг условий кристаллизации комплекса LpD с NAD+/NADH методом висячей капли и в капиллярах. Были найдены условия кристаллизации, которые предложено в дальнейшем использовать для кристаллизации комплекса на МКС.