ИСТИНА

CBS-РРазы относятся к семейству II пирофосфатаз, которые имеют в своем составе прочно связанный ион Co2+ или Mn2+. Основная функция фермента состоит в гидролизе пирофосфата, для которого требуется присутствие ионов Mg2+, образующих с ферментом и субстратом быстро диссоциирующие комплексы. Каждая субъединица CBS-РРазы состоит из двух каталитических доменов (DHH и DHHA2) и регуляторной части, образованной парой нуклеотид-связывающих CBS-доменов и одним DRTGG-доменом (рис. 1 в приложенном файле). Активный центр расположен между каталитическим доменами. Связывание AMP и ADP в CBS-доменах ингибирует фермент, тогда как связывание ATP и диаденозинполифосфатов активирует его. Известна пространственная структура отдельной регуляторной части в виде гомодимера и гомологичных каталитических доменов димерной «канонической» пирофосфатазы семейства II, которая не имеет регуляторной части. Ранее мы показали, что CBS-РРаза является гомотетрамером (статья 6 в списке публикаций) со сложным взаимодействием между регуляторными частями, с одной стороны, и каталитическими, с другой. С помощью гомологического моделирования (программа Modeller) мы предложили две вероятные модели структуры тетрамера, которые различаются организацией димеров каталитических частей. В одном варианте каталитические DHHA2-домены оказываются сближены в пространстве (модель А на рис. 1), а в другом случае они разведены и ориентированы наружу структуры (модель Б). Целью проекта является определение пути, по которому информация о связывании нуклеотида в CBS-доменах передается в каталитический центр, что позволит сделать выбор между этими моделями. Гипотеза состоит в том, что конформационное изменение при связывании ингибитора или активатора в регуляторной части затрагивает оба CBS-домена и передается в конечном счете на каталитический DHHA2-домен. В результате затрудняется открытие активного центра фермента для связывания субстрата (в случае нуклеотидов-ингибиторов) либо, наоборот, движение DHHA2-домена облегчается (в случае нуклеотидов-активаторов). Эти предсказания соответствуют модели А. Объектами исследования будут CBS-РРаза бактерии Desulfitobacterium hafniense и каноническая пирофосфатаза семейства II из бактерии Streptococcus gordonii. В нашем распоряжении есть соответствующие генетические конструкции и клетки Escherichia coli, продуцирующие белки дикого штамма. Планируемые исследования будут состоять из четырех частей. Во-первых, мы планируем получить мутантную форму Dh-РРазы с делецией каталитического DHHA2-домена и определить для нее методом изотермического калориметрического титрования сродство к регуляторным лигандам (AMP и Ap4A). Этот подход возможен, поскольку при делеции DHHA2-домена не затрагивается регуляторный центр, который должен сохранить возможность связывания лигандов. Это позволит оценить вклад DHHA2-домена в формировании напряженной структуры полноразмерного фермента, который ожидается разным для моделей А и Б. Во-вторых, мы планируем получить и кинетически охарактеризовать две мутантные формы Dh-РРазы, содержащие по 2-3 мутации в предполагаемых областях контакта каталитических частей гомотетрамера Dh-РРазы в соответствии с рассматриваемыми моделями (рис. 1). Для модели А должны сработать замены в DHHA2-домене, для модели Б - замены в DHH-домене. В-третьих, мы оценим вклад аминокислотных остатков CBS1-домена в междимерной области контакта регуляторных частей в регуляцию CBS-РРазы. Для этого мы получим и охарактеризуем 7-10 мутантных форм фермента с одиночными заменами аминокислотных остатков в CBS1-домене. Это позволит проверить гипотезу о том, что изменение конформации регуляторной вставки осуществляется только за счет движения CBS2-домена, без участия CBS1-домена. В-четвертых, мы проведем валидацию предложенных моделей гомотетрамера CBS-РРазы с помощью методов молекулярной динамики для структурного объяснения полученных экспериментальных данных. В работе будет использован комплекс современных биоинформатических, биохимических, физико-химических и молекулярно-генетических методов. Все планируемые результаты будут новыми, не описанными в литературе.

CBS-PPases belong to the so-called Family II pyrophosphatases, which hydrolyze pyrophosphate in the presence of Mg2+ ions and contain a tightly-bound Co2+ or Mn2+ ion. Each subunit of CBS-PPase (Fig. 1 in the attached file) is formed by two catalytic domains (DHH and DHHA2) and 2-3 regulatory domains (a pair of CBS and, frequently, one DRTGG domains). The active site is located between the catalytic domains. AMP or ADP bound to the CBS domains inhibit whereas ATP or diadenosine polyphosphates activate CBS-pyrophosphatase. Tertiary structures of a separate regulatory part and homologous catalytic domains of “canonical” Family II pyrophosphatase (lacking the regulatory part) have been reported. We have previously shown that CBS-PPase is homotetramer (article 6 in the list of publications) with a complex interaction within the regulatory and catalytic parts, and between them. Using homology modeling (Modeller program), we have previously proposed two possible models of the tetramer structure, which differ in the dimerization of the catalytic parts. In model A, the catalytic DHHA2 domains are close to each other, (Fig. 1), whereas they are separated in space and oriented outward of the structure in model B. The project aims at determining the pathway by which information about nucleotide binding in the CBS domains is transmitted to the catalytic site, which will allow a choice between these models. The hypothesis is that the inhibitor- or activator-induced conformational change in both CBS domains of the regulatory part is finally transmitted to the catalytic DHHA2 domain. This results in active center opening for binding the substrate in the case of activator binding or its partial closure in the case of inhibitor binding. This structural mechanism is more consistent with model A. The proteins to be studied will include the CBS-PPase of the bacterium Desulfitobacterium hafniense (Dh-PPase) and the canonical Family II pyrophosphatase of the bacterium Streptococcus gordonii (Sg-PPase). The genetic constructs for producing the wild type proteins in Escherichia coli are available to us. The planned studies will consist of four parts. First, we will delete the DHHA2 domain from Dh-PPase and characterize the deletion variant in terms of affinity for regulatory ligands (AMP and Ap4A) by isothermal titration calorimetry. This approach is possible because DHHA2 domain deletion is not expected to destroy the regulatory site, which should retain the ability to bind the ligands. The results will allow to estimate the contribution of the DHHA2 domain to the formation of a strained structure, expected for model A but not model B in the full-size enzyme. Second, we will produce and kinetically characterize two forms of Dh-PPase with 2-3 mutations in the presumed contact zones in the DHHA2 domain and DHH domain pairs. Mutations in the DHHA2 contacts are expected to have larger effects in terms of model A, and visa versa. Third, we will estimate the contribution of the amino acid residues forming CBS1 domain contact of the interdimeric interface to CBS PPase regulation. To accomplish this, we will produce and characterize 7-10 enzyme variants with single amino acid substitutions in the CBS1 domain. We will test in this way the hypothesis that the conformational change in the regulatory part involves solely CBS2 domain displacements, without a contribution of the CBS1 domain. Fourth, we will validate the proposed models of the CBS-PPase homotetramer using molecular dynamics methods to provide a structural explanation of the experimental data. This study will employ a set of contemporary bioinformatic, biochemical, physico-chemical and molecular genetics methods. All the planned results will be novel, not reported previously.

Выполнение проекта позволит проверить гипотетический механизм регуляции CBS-белков через координированные изменения во множественных зонах контакта субъединиц, направленные в конечном итоге на DHHA2-домен. Даже если наша гипотеза не подтвердится, результаты обеспечат значимый прогресс в понимании механизма регуляции через CBS-домены. Планируемые исследования соответствуют мировому уровню или даже опережают его, тем самым создавая базу для исследования CBS-белков в целом, в том числе CBS-белков клинической важности. В практическом аспекте, CBS-РРаза является жизненно важным клеточным белком в клинически значимых патогенных бактериях и имеет в своем составе уникальный DRTGG-домен, что делает ее перспективной «мишенью» для разработки антибактериальных препаратов.

Руководитель проекта имеет девятилетний опыт работы в области энзимологии и молекулярной биологии, в том числе с пирофосфатазами, бактериальными родопсинами; им накоплен значительный опыт в исследовании энергопреобразующих ферментов бактерий с использованием современных биохимических и биофизических методов и подходов. Ранее им в соавторстве с коллегами были опубликованы работы по CBS-РРазам что подтверждается приведенным выше списком публикаций. В результате этой работы был установлен кооперативный характер регуляции CBS-РРаз адениновыми нуклеотидами, впервые для CBS-белков обнаружена регуляция диаденозинполифосфатами, обнаружены новые регуляторные лиганды (сАМР, фруктозо-1-фосфат, аденин и аденозин), установлено наличие каталитической асимметрии в работе мембранной пирофосфатазы, в структуре бактериального натрий-транспортирующего родопсина обнаружен консервативный остаток глицина, необходимый для связывания светоулавливающей антенны. Руководителем подобраны и провалидированы оптимальные параметры силовых полей для фосфата, имидодифосфата и пирофосфата в составе комплексов с ионами магния для молекулярной динамики белковых комплексов с ними. В ходе работы были освоены методики наработки и очистки препаратов белков, включая CBS-РРазы (с помощью различных видов хроматографии), аналитического ультрацентрифугирования (включая обработку данных), калориметрии (включая обработку данных), электрофореза, определения ферментативной активности высокочувствительным непрерывным методом, кинетического анализа сложных ферментных систем (включая диссоциирующие ферменты), молекулярно-динамического моделирования. Для целей моделирования создана персональная графическая станция, которая оснащена современными программами расчетов, полностью освоенными руководителем.