ИСТИНА

Рак предстательной железы (РПЖ) - сложное и биологически неоднородное заболевание, которое является одним из наиболее часто диагностируемых злокачественных новообразований у мужчин во всем мире и остается одной из основных причин их смерти от рака. Несмотря на то, что рак простаты является одним из немногих медленно растущих видов злокачественных опухолей, он становится потенциально смертельным при метастазировании. Следовательно, его раннее выявление особенно важно для эффективного лечения. Функциональные методы визуализации для обнаружения рака простаты включают трансректальное ультразвуковое исследование, магнитно-резонансную томографию (МРТ), компьютерную томографию (КТ), однофотонно-эмиссионную томографию (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ). Однако специфичность существующих методов визуализации, используемых при оценке РПЖ, ограничена. Выбор методов лечения РПЖ зависит от стадии заболевания. При локализованном РПЖ варианты варьируются от радикальной простатэктомии до дистанционной лучевой терапии. При распространенном/метастатическом РПЖ предпочтительно использовать андрогенную депривационную терапию (AДТ). Как только опухоли развивают резистентность к андрогенам, варианты сокращаются до альтернативных гормональных терапий с энзалутамидом или химиотерапии. Предпочтительными терапевтическими средствами являются таксаны, такие как доцетаксел или кабазитаксел. Другие варианты терапии различаются лишь в отношении к их побочным эффектам. Поэтому продолжаются разработки по созданию новых диагностических и терапевтических препаратов, нацеленных на РПЖ. Перспективным методом лечения рака простаты является использование адресной доставки лекарственных средств – направленный транспорт лекарственного вещества в заданную область организма, органа или клетки. Преимуществами этого метода является уменьшение побочных эффектов и вводимой дозы препарата при улучшении качества диагностики и терапии. В рамках данной работы будет осуществлен синтез ряда гетеробивалентных конъюгатов направленных на два рецептора, сверхэкспрессирующихся при раке предстательной железы (РПЖ),а именно простатический специфический мембранный антиген (PSMA) и рецептор пептида, высвобождающего гастрин (GRPR). Таким образом в конъюгате удастся создать гетеровалентную систему, изготовленную из пептидов двух неконкурирующих семейств, которая позволит увеличить параметры селективности и специфичности по отношению к РПЖ, а также продемонстрировать заметный синергетический эффект.

The special temporary role of the diagnosis of prostate cancer plays a key role in the treatment of diseases, since a tumor diagnosed in the last stages is difficult to detect. The implementation of the project makes it possible to obtain previously unknown conjugates of tissue-specific ligands with the DOTA chelating agent, which exhibit a directed action to the prostate-specific membrane antigen (PSMA) and the gastrin-releasing peptide receptor (GRPR). Although approaches to binding GRPR and PSMA radiolabeled heterobivalent ligands only appeared in 2014, there were already several factors associated with the presence of high potency in this group of heterobivalent peptide agents. The reason for the development of agents including bombesin derivatives (targeting GRPR) and the structural motif Glu-urea-Lys (targeting PSMA) for early prostate carcinoma (PCa) encountering changes in expression level with disease progression. In the early phase of PCa, GRPR is significantly expressed on the surface of cancer cells. On the contrary, PSMA expression strongly develops disease progression, metastasis and differentiation, but in some cases it is completely absent or expressed rather heterogeneously, which limits the achievable sensitivity unexpectedly directed to PSMA as the only target. Thus, diagnostic agents that act on only one of the two amino acid target structures do not allow visualization of all manifestations. Therefore, a combined imaging agent that binds GRPR and PSMA will be useful for the development of malignant tissue at all stages of PCa development. The scientific novelty of the project lies in the construction and complex structure of the linker that combines the diagnostic fragment and ligands to the receptors, as well as its appointment in a heterobivalent construct that binds the ligand and the chelating agent. The final compounds synthesized consist of four structural fragments: 1) a modified Glu-urea-Lys urea-based ligand with high affinity for PSMA 2) a ligand based on a bombesin derivative associated with GRPR 3) a linker/linkers combining two differently directed ligands, with variation its purpose within a heterodimeric construct, use, hydrophobicity/hydrophilicity, rigidity, which is important for achieving favorable affinity and pharmacokinetic profile 4) DOTA chelating agent for targeted delivery of 68Ga radionuclide to prostate cancer cells.

Результатом выполнения данного проекта должны стать получение новых эффективных систем адресной доставки к раковым клеткам предстательной железы, представляющих собой низкомолекулярные ковалентные конъюгаты этих лигандов с диагностическим агентами, а также выявление конъюгата-лидера, наиболее перспективного для изучения in vivo.

Руководителем настоящего проекта был накоплен большой опыт работы в области дизайна, разработки и осуществления синтетических схем получения разнообразных конъюгатов с диагностическими и терапевтическими агентами. В 2021 году была успешно защищена кандидатская диссертация по теме «Полипептидные молекулы и их конъюгаты с диагностическими и терапевтическими агентами для адресной доставки в раковые клетки предстательной железы». Для создания конъюгатов были оптимизированы методики пептидного синтеза, реакций биоконъюгирования, проведена оценка наиболее оптимальных структур лигандов для связывания с PSMA.Было выполнено исследование текущих перспектив и наиболее интересных направлений в синтезе бимодальных конъюгатов направленных к PSMA рецептору. В результате был получен ряд неописанных ранее конъюгатов c комбинацией диагностический агент/терапевтический агент (сульфо-Су5/Доцетаксел), а также с монометилауристатином Е как терапевтическим агентом, с флуоресцентными метками, доцетакселом. Для полученных соединений были оптимизированы методики синтеза и выделения, произведены комплексные исследования физико-химических и биологических свойств. Полученные низкомолекулярные системы доставки терапевтических агентов на основе производных Glu-urea-Lys обладают превосходным сродством к рецептору PSMA в наномолярном диапазоне концентраций и высоким уровнем цитотоксичности, сравнимым с исходными препаратами. А конъюгаты с диагностическими агентами позволяют визуализировать раковые поражения предстательной железы, что продемонстрировано в exvivoи invivoэкспериментах. В целом полученные результаты подчеркивают потенциал PSMA-направленных конъюгатов для лечения РПЖ.

1) Разработаны методики синтеза лигандов к PSMA на основе фрагмента мочевины DCL (Glu-Urea-Lys) для направленного транспорта в клетки простаты. Было проведено их комплексное физико-химическое исследование с целью установления их состава и структуры с использованием методов: ЯМР 1H и 13C, ЯМР 2D, масс-спектрометрии высокого разрешения и ВЭЖХ-Масс-спектрометриии. Проведена оптимизация положения и конфигурации «точки ветвления» (аминокислота Lys) в молекуле, и осуществлено присоединение хелатирующего агента, к полипептидной последовательности. 2) Были проведены исследования рецепторного связывания in vitro с использованием линий клеток рака предстательной железы человека (PSMA+; GRPR-) LNCaP для новых синтезированных лигандов к PSMA с варьированием положения и конфигурации «точки ветвления». Исследования были основаны на способности полученных лигандов ингибировать расщепление N-ацетил-L-аспартил-L-глутамата под действием PSMA-рецептора на клеточной линии LNCaP (ПСМА++). На основе результатов данного исследования можно сделать следующие выводы: 1) все полученные лиганды обладают значительно большим сродством к PSMA, чем нативный лиганд DCL (IC50±SD = 547±389 нM) (более чем на порядок); 2) наиболее аффинными являются лиганды с пептидными последовательностями Phe(L)Phe(L)GlyLys(L) (IC50±SD = 9±2 нM) и Phe(L)Phe(L)GlyLys(L)Gly (IC50±SD = 11±2 нM). Это предполагает возможность их использования для получения целевых конъюгатов. Однако, в случае лиганда Phe(L)Phe(L)GlyLys(L) при проведении реакции пептидного синтеза между С-концевой пептидной последовательностью и вводимым фрагментом, содержащим NH2, возможно протекание эпимеризации по α-C при COOH. Чтобы избежать этого нежелательного процесса для дальнейших исследованиях и отработки методов получения гетеробивалентных конъюгатов была выбрана пептидная последовательность Phe(L)Phe(L)GlyLys(L)Gly. 3) Осуществлена разработка и сравнение с точки зрения эффективности, трудоемкости, особенностей синтеза и выделения продуктов и выходов целевых соединений 6 Способов стереоселективного синтеза гетеробивалентных конъюгатов для доставки к PSMA\GRP рецепторам хелатирующего агента DOTA, включающих от 40 до 44 последовательных стадий. Лучший синтетический путь - Способ 3 для получения гетеробивалентных конъюгатов (по совокупности параметров): 1) Получение PSMA-вектора 6; 2) Сборка пептидной последовательности, входящей в состав лиганда к PSMA, на CTC-2 и объединение с векторным фрагментом 6; 3) Твердофазная сборка пептидной последовательности JMV594 со спейсером и точкой ветвления Lys на смоле Rink Amide-MBHA; 4) Присоединение PSMA лиганда 18 к GRPr лиганду 22, закреплённому на MBHARinkAmide; 5) Удаление ГБВ лиганда 26 со смолы Rink Amide-MBHA; 6) Присоединение (НО)3DOTA-COOSu к ГБВ лиганду 26х в растворе 4) Определены оптимальные условия воспроизводимого стереоселективного синтеза гетеробивалентного лиганда к PSMA\GRP рецепторам, который может выступать как молекулярная платформа для направленной доставки различных терапевтических и/или диагностических агентов к этим рецепторам. Предлагаемая оптимальная синтетическая схема состоит из: 1) Получение PSMA-вектора 6; 2) Сборка пептидной последовательности, входящей в состав лиганда к PSMA, на CTC-2 и объединение с векторным фрагментом 6; 3) Твердофазная сборка пептидной последовательности JMV594 со спейсером и точкой ветвления Lys на смоле Rink Amide-MBHA; 4) Присоединение PSMA лиганда 18 к GRPr лиганду 22, закреплённому на MBHARinkAmide; 5) Удаление ГБВ лиганда 26 со смолы Rink Amide-MBHA. 5) Все полученные соединения охарактеризованы комплексом физико-химических методов анализа (с применением ЯМР 1Н, 13С, 15N; 2D ЯМР; МСВР, ВЭЖХ-МС). 6) Впервые для двух промежуточных соединений подобной структурной композиции 18х (лиганд к PSMA) 20х (JMV594 = лиганд к GRPr) проведено полное соотнесение сигналов в ЯМР 1Н и 13С (+ 15N для 20х) спектрах с использованием 2D ЯМР; на основании этих данных дано полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах этих соединений. 7) Впервые для двух целевых соединений подобной структурной композиции (лиганд и конъюгат к PSMA\GRP рецепторам) ( 26х (ГБВ лиганд) и 27 (ГБВ конъюгат с DOTA) проведено полное соотнесение сигналов в ЯМР 1Н и 13С ( + 15N для 26х ) спектрах с использованием 2D ЯМР; на основании этих данных дано полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах этих соединений. 8) Были подготовлены к публикации следующие материалы: 2 статьи 1) Nikolay Y. Zyk, Stanislav A. Petrov, Maria V. Zavertkina, Anastasia A. Uspenskaya, Pavel A. Krasnikov, Natalia S. Dashkova, Elena K. Beloglazkina, Alexander G. Majouga, Nikolay V. Zyk, Aleksei E. Machulkin. «Choice of the optimal synthetic approach for the polypeptide ligands of prostatic specific membrane antigen preparation»б Mendeleev Communications (2023 г.); 2) Stanislav A. Petrov, Gleb P. Grigoriev, Grigory А. Orlov, Nikolay Y. Zyk, Yuri K. Grishin, Vitaly A. Roznyatovsky, Maria A. Beloglazkina, Juliana V. Kuznetsova, Aleksei E. Machulkin, Elena K. Beloglazkina. «Routes to PSMA/GRPr targeted heterobivalent conjugates: synthetic strategies and their evaluation» (2024 г.) и 2 тезиса докладов на всероссийских конференциях: 1) Зык Н.Ю., Петров С.А., Мачулкин А.Э. «Дизайн и синтез двойных конъюгатов с лигандами простатического специфического мембранного антигена», «XXX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных» «Ломоносов-2023». 2) Петров С.А., Григорьев Г.П., Орлов Г.А., Зык Н.Ю., Мачулкин А.Э.; «Разработка новых гетеробивалентных конъюгатов для диагностики рака предстательной железы», «Марковниковские чтения: Органическая химия от Марковникова до наших дней».