Активные формы кислорода: роль в регуляции тонуса системных артерий в период раннего постнатального онтогенезаНИР

Reactive oxygen species: role in the regulation of systemic arterial tone during early postnatal ontogenesis

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Активные формы кислорода: роль в регуляции тонуса системных артерий в период раннего постнатального онтогенеза
Результаты этапа: В последние годы в литературе появляется все больше данных о «полезной» роли АФК в сердечно-сосудистой системе (Knock, 2019; Tejero et al., 2019). Участие АФК в регуляции тонуса сосудов на сегодняшний момент также не вызывает сомнений (Knock, 2019; Tejero et al., 2019). Механизмы вазомоторной роли АФК описаны достаточно подробно, но лишь для взрослого половозрелого организма (Knock, 2019; Tejero et al., 2019). Важно отметить, что механизмы регуляции тонуса сосудов в период раннего постнатального онтогенеза обладают целым рядом особенностей и существенно отличаются от таковых во взрослом возрасте (Gaynullina et al., 2019; Shvetsova et al., 2021). Несмотря на этот факт, вазомоторная роль АФК в период раннего постнатального онтогенеза изучена существенно хуже, а большинство работ, посвященных этой теме, сконцентрировано на сосудах малого круга кровообращения. Кроме того, известно о важном адаптивном значении АФК в сердечно-сосудистой системе новорожденных. Так, показано, что сокращение артериального протока, необходимое для разобщения двух кругов кровообращения плода, во многом обусловлено влиянием АФК (Villamor et al., 2019). Помимо этого, известно, что АФК способствуют сокращению периферических сосудов новорожденного в условиях гипоксии (часто сопутствующей процессу родов) с целью направить кровь к мозгу и тем самым защитить его от пагубного гипоксического воздействия (Giussani, 2016). Тем не менее практически ничего не известно о том, какова же роль АФК в регуляции тонуса периферических сосудов в нормальных условиях (в условиях нормоксии) в период раннего постнатального онтогенеза. В соответствии с планом, заявленным на 2023 год, нами была проведена оценка вазомоторной роли АФК, продуцируемых такими ферментами как NADPH-оксидазы (NOXs) и супероксиддисмутазы (SODs), в подкожной артерии взрослых крыс и крысят в периоде раннего постнатального онтогенеза (в возрасте 12-15 дней). Чтобы понять, на каком уровне реализуется вазомоторное влияние этих АФК, эксперименты были проведены как на сосудах с интактным эндотелием, так и в сосудах с механически удаленным эндотелием. Функциональные эксперименты были дополнены блоком молекулярно-биологических исследований по оценке содержания мРНК и белка каталитических/регуляторных субъединиц NOXs и SODs в ткани артерий животных разного возраста. Наконец, нами была проведена работа по отработке метода регистрации продукции супероксидного анион-радикала в ткани подкожной артерии крысят в возрасте 12-15 дней с применением метода тканевой хемилюминесценции. Таким образом, все запланированные на 2023 год работы выполнены полностью. ПРОДУЦИРУЕМЫЕ NADPH-ОКСИДАЗАМИ АФК ОБЛАДАЮТ ПРОКОНСТРИКТОРНЫМ ВЛИЯНИЕМ В ПОДКОЖНОЙ АРТЕРИИ КРЫС В ПЕРИОД РАННЕГО ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА, НО НЕ ВО ВЗРОСЛОМ ВОЗРАСТЕ NADPH-оксидазный ферментативный комплекс является одним из главных источников АФК в клетке (Knock, 2019). В связи с этим мы оценили эффект его ингибитора на сократительные ответы подкожной артерии – сосуда мышечного типа, у взрослых крыс и крысят. По нашим данным, ингибитор NOXs VAS2870 вызывал существенное ослабление сократительных ответов подкожной артерии крысят, но не оказывал эффекта в артериях взрослых крыс. В связи с тем, что экспрессия NOXs показана как для эндотелиального, так и для гладкомышечного слоя артерий (Tejero et al., 2019), представлялось важным сравнить эффекты VAS2870 в артериях с интактным и удаленным эндотелием. Мы показали, что эффект VAS2870 в сосудах с интактным и удаленным эндотелием одинаков: у взрослых крыс эффекта не обнаружено, а у крысят происходит значительное ослабление сократительных ответов на агонист α1-адренорецепторов метоксамин. На основании полученных данных можно сделать сразу два заключения. Во-первых, продуцируемые NOXs АФК обладают выраженным проконстрикторным влиянием в подкожной артерии крысят в период раннего постнатального онтогенеза, но не во взрослом возрасте. Во-вторых, это влияние реализуется преимущественно на уровне гладкомышечных клеток артерий. Мы предположили, что более выраженный функциональный вклад NOXs в сосудах крысят связан с большей экспрессией этого фермента в данном возрасте. По нашим данным наиболее экспрессируемыми изоформами NOXs в подкожной артерии являются NOX2 и NOX4. Поэтому экспрессию именно этих изоформ мы оценивали далее. Результаты экспериментов по оценке содержания белка соотнеслись с функциональными данными: в артериях крысят количество белка каталитических субъединиц NOX2 и NOX4 было значительно выше, чем в ткани артерий взрослых крыс. Отметим, что NOX2 продуцирует супероксидный анион-радикал, который затем дисмутируется в пероксид водорода. NOX4 же сразу продуцирует пероксид водорода. Таким образом, как супероксидный анион-радикал, так и пероксид водорода могут быть теми формами АФК, которые обладают проконстрикторным влиянием в гладкой мышце подкожной артерии крысят в результате работы NOXs. Удивительно, но паттерн экспрессии NOXs на уровне мРНК отличался от такового на уровне белка. По нашим данным мРНК как каталитических субъединиц NOX2 и NOX4, так и регуляторной субъединицы NOX2 p22phox была ниже в ткани подкожной артерии крысят по сравнению со взрослыми крысами. Такое несоответствие паттерна экспрессии на уровне мРНК и белка мы связываем с тем, что в исследуемом нами возрасте 12-15 дней уже происходит падение экспрессии мРНК этих ферментов, тогда как белок все еще поддерживается на высоком уровне. Вероятно, в более раннем возрасте (до 1 недели) можно было бы обнаружить более высокий уровень мРНК NOXs. Итак, совокупность полученных данных позволяет заключить, что продуцируемые NOXs (вероятно, NOX2 и NOX4) АФК обладают важной вазомоторной ролью в период раннего постнатального онтогенеза, а именно, способствуют сокращению гладкомышечных клеток артерий в этом возрасте, что связано с большим количеством данного фермента. ПОДАВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ Cu,Zn-СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗ ОСЛАБЛЯЕТ СОКРАЩЕНИЕ ГЛАДКОЙ МЫШЦЫ ПОДКОЖНОЙ АРТЕРИИ КРЫСЯТ, НО НЕ ВЗРОСЛЫХ КРЫС Еще одними важными источниками АФК в клетках сосудов являются ферменты супероксиддисмутазы (Fukai and Ushio-Fukai, 2011). Несмотря на то, что их часто относят к антиоксидантным системам, в результате своей деятельности они продуцируют пероксид водорода – одну из форм АФК, и, следовательно, также могут вносить вклад в регуляцию тонуса сосудов. Существует три изоформы этого фермента – цитоплазматическая (SOD1), митохондриальная (SOD2) и внеклеточная (SOD3). Помимо различной локализации в клетке, эти изоформы отличаются ионами металлов, входящими в их активный центр. Так, в состав активного центра SOD1 и SOD3 входят ионы меди и цинка, а SOD2 – марганца (Fukai and Ushio-Fukai, 2011). В связи с этим, SOD1 и SOD3 часто называют Cu,Zn-супероксиддисмутазами. В качестве ингибитора этих изоформ используют вещество DETC, хелатирующее ионы Cu и Zn (Paravicini et al., 2004; Sallam and Laher, 2020). Относительно специфических ингибиторов для SOD2 на сегодняшний момент не известно. В связи с этим в функциональных экспериментах мы использовали DETC, и, таким образом, оценивали совместный вклад SOD1 и SOD3 в регуляцию тонуса подкожной артерии. Наши эксперименты продемонстрировали, что ингибитор Cu,Zn-супероксиддисмутаз DETC не повлиял на вызываемые метоксамином сократительные ответы подкожной артерии с интактным эндотелием ни у взрослых крыс, ни у крысят. Примечательно, что после удаления эндотелия DETC вызывал выраженное ослабление сокращения артерий крысят, тогда как у взрослых крыс эффекта снова не наблюдалось. Иными словами эффект ингибитора Cu,Zn-супероксиддисмутаз проявлялся (1) только в артериях крысят и (2) в условиях отсутствия эндотелия. Существует несколько возможных объяснений обнаруженного эффекта. Так, подавление активности Cu,Zn-супероксиддисмутаз, с одной стороны, может приводить к накоплению супероксидного анион-радикала, а с другой стороны – к уменьшению количества пероксида водорода. Иначе говоря, ослабление сокращения артерий крысят на фоне DETC может быть связано как с резко увеличившимся количеством супероксидного анион-радикала и выраженным окислительным стрессом, так и с уменьшившимся количеством пероксида водорода, который в гладкой мышце обладает проконстрикторным влиянием. Кроме того, не до конца понятно, почему эффект DETC не обнаруживается в сосудах с интактным эндотелием, но ярко проявляется в сосудах без эндотелия. Возможно, продуцируемый эндотелиальными и гладкомышечными Cu,Zn-супероксиддисмутазами пероксид водорода обладает противоположным влиянием на сосудистый тонус – поэтому при блокаде этого фермента одновременно в двух слоях мы не видим эффекта. Наконец, ранее нами было показано, что для сосудов крысят в периоде раннего постнатального онтогенеза характерна высокая продукция эндотелиального NO (Gaynullina et al., 2013; Sofronova et al., 2016). Не исключено, что этот NO подавляет активность Cu,Zn-супероксиддисмутаз, в результате чего эффекта DETC в сосудах с эндотелием не удается обнаружить. Мы надеемся, что запланированные на следующий год эксперименты позволят ответить на эти вопросы. По данным ПЦР в реальном времени в сосудах обеих возрастных групп экспрессируются все три изоформы SOD. Сравнивая экспрессию SODs в артериях двух возрастных групп, мы обнаружили, что как на уровне мРНК, так и на уровне белка содержание SOD2 существенно выше в ткани подкожной артерии взрослых крыс по сравнению с крысятами. Однако сравнить функциональный вклад SOD2 в регуляцию тонуса сосудов, как уже было сказано выше, представляется невозможным ввиду отсутствия селективных ингибиторов данной изоформы фермента. Что касается SOD1 и SOD3, ингибитор которых (DETC) был использован нами в функциональных экспериментах, то как и в случае с NOXs мы обнаружили разнонаправленное изменение экспрессии на уровне мРНК и белка. Так, по нашим данным экспрессия мРНК SOD1 и SOD3 ниже в ткани артерий крысят, тогда как на уровне белка содержание SOD1 оказывается одинаковым, а SOD3 – увеличенным в артериях крысят. Возможные причины несоответствия в возрастных изменениях содержания мРНК и белка уже были озвучены в предыдущем разделе. Важно также отметить, что как у взрослых крыс, так и у крысят наиболее представленной изоформой являлась SOD3. Принимая во внимание повышенное содержание белка этого фермента у крысят, мы полагаем, что АФК, продуцируемые именно этой изоформой, вносят наибольший вклад в регуляцию тонуса подкожной артерии в период раннего постнатального онтогенеза. Таким образом, на основании данных функциональных и молекулярно-биологических экспериментов можно предположить, что активность SOD3 играет важную роль в регуляции тонуса подкожной артерии 12-15-дневных крысят. «Знак» ее влияния может быть противоположным в эндотелии и гладкой мышце, а также может быть предметом регуляции со стороны эндотелиальных факторов, например, NO. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: 1. Tejero J, Shiva S, Gladwin MT (2019) Sources of vascular nitric oxide and reactive oxygen species and their regulation. Physiol Rev 99:311–379. https://doi.org/10.1152/physrev.00036.2017 2. Knock GA (2019) NADPH oxidase in the vasculature: Expression, regulation and signalling pathways; role in normal cardiovascular physiology and its dysregulation in hypertension. Free Radic Biol Med 145:385–427. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2019.09.029 3. Gaynullina DK, Schubert R, Tarasova OS (2019) Changes in endothelial nitric oxide production in systemic vessels during early ontogenesis—A key mechanism for the perinatal adaptation of the circulatory system. Int J Mol Sci 20:1–12. https://doi.org/10.3390/ijms20061421 4. Shvetsova AA, Gaynullina DK, Tarasova OS, Schubert R (2021) Remodeling of Arterial Tone Regulation in Postnatal Development: Focus on Smooth Muscle Cell Potassium Channels. Int J Mol Sci 22:5413. https://doi.org/10.3390/ijms22115413 5. Villamor E, Moreno L, Mohammed R, Pérez-Vizcaíno F, Cogolludo A (2019) Reactive oxygen species as mediators of oxygen signaling during fetal-to-neonatal circulatory transition. Free Radic Biol Med 142:82–96. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2019.04.008 6. Giussani DA (2016) The fetal brain sparing response to hypoxia: Physiological mechanisms. J Physiol 594:1215–1230. https://doi.org/10.1113/JP271099 7. Fukai T, Ushio-Fukai M (2011) Superoxide dismutases: Role in redox signaling, vascular function, and diseases. Antioxidants Redox Signal 15:1583–1606. https://doi.org/10.1089/ars.2011.3999 8. Sallam NA, Laher I (2020) Redox signaling and regional heterogeneity of endothelial dysfunction in db/db mice. Int J Mol Sci 21:1–20. https://doi.org/10.3390/ijms21176147 9. Paravicini TM, Chrissobolis S, Drummond GR, Sobey CG (2004) Increased NADPH-Oxidase Activity and Nox4 Expression during Chronic Hypertension Is Associated with Enhanced Cerebral Vasodilatation to NADPH In Vivo. Stroke 35:584–589. https://doi.org/10.1161/01.STR.0000112974.37028.58 10. Gaynullina D, Lubomirov LT, Sofronova SI, Kalenchuk VU, Gloe T, Pfitzer G, Tarasova OS, Schubert R (2013) Functional remodelling of arterial endothelium during early postnatal development in rats. Cardiovasc Res 99:612–621. https://doi.org/10.1093/cvr/cvt138 11. Sofronova SI, Borzykh AA, Gaynullina DK, Kuzmin I V., Shvetsova AA, Lukoshkova E V., Tarasova OS (2016) Endothelial nitric oxide weakens arterial contractile responses and reduces blood pressure during early postnatal development in rats. Nitric Oxide 55–56:1–9. https://doi.org/10.1016/j.niox.2016.02.005 12. Incalza MA, D’Oria R, Natalicchio A, Perrini S, Laviola L, Giorgino F (2018) Oxidative stress and reactive oxygen species in endothelial dysfunction associated with cardiovascular and metabolic diseases. Vascul Pharmacol 100:1–19. https://doi.org/10.1016/j.vph.2017.05.005 13. Wedgwood S, Steinhorn RH, Lakshminrusimha S (2019) Optimal oxygenation and role of free radicals in PPHN. Free Radic Biol Med 142:97–106. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2019.04.001 14. Zhang Y, Murugesan P, Huang K, Cai H (2020) NADPH oxidases and oxidase crosstalk in cardiovascular diseases: novel therapeutic targets. Nat Rev Cardiol 17:170–194. https://doi.org/10.1038/s41569-019-0260-8 15. Mittal M, Urao N, Hecquet CM, Zhang M, Sudhahar V, Gao XP, Komarova Y, Ushio-Fukai M, Malik AB (2015) Novel role of reactive oxygen species-activated trp melastatin channel-2 in mediating angiogenesis and postischemic neovascularization. Arterioscler Thromb Vasc Biol 35:877–887. https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.114.304802 16. Chen C, Li L, Zhou HJ, Min W (2017) The role of NOX4 and TRX2 in angiogenesis and their potential cross-talk. Antioxidants 6:. https://doi.org/10.3390/antiox6020042 17. Clempus RE, Sorescu D, Dikalova AE, Pounkova L, Jo P, Sorescu GP, Lassègue B, Griendling KK (2007) Nox4 is required for maintenance of the differentiated vascular smooth muscle cell phenotype. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27:42–48. https://doi.org/10.1161/01.ATV.0000251500.94478.18 18. Jankov RP, Negus A, Keith Tanswell A (2001) Antioxidants as therapy in the newborn: Some words of caution. Pediatr Res 50:681–687. https://doi.org/10.1203/00006450-200112000-00009 19. Lee JW, Davis JM (2011) Future applications of antioxidants in premature infants. Curr Opin Pediatr 23:161–166. https://doi.org/10.1097/MOP.0b013e3283423e51
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Активные формы кислорода: роль в регуляции тонуса системных артерий в период раннего постнатального онтогенеза
Результаты этапа: В соответствии с планом, заявленным на 2024 год, мы сравнили продукцию АФК (а именно – супероксидного анион-радикала) в ткани артерий взрослых крыс и крысят. Кроме того, нами были изучены механизмы вазомоторного влияния АФК, продуцируемых NADPH оксидазами и супероксиддисмутазами, в подкожной артерии крысят в периоде раннего постнатального онтогенеза. Данные задачи являются логичным продолжением экспериментов, проведенных в рамках первого года выполнения Проекта, которые демонстрируют более выраженную функциональную роль АФК в регуляции тонуса артерий крысят по сравнению со взрослыми животными (Shvetsova et al., 2023, 2024). Таким образом, все запланированные на 2024 год работы полностью выполнены. ПРОДУЦИРУЕМЫЙ Cu,Zn-SODs ПЕРОКСИД ВОДОРОДА ОБЛАДАЕТ ПРОКОНСТРИКТОРНЫМ ВЛИЯНИЕМ В ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ АРТЕРИЙ КРЫСЯТ Как известно, Cu,Zn-SODs являются важнейшим источником пероксида водорода (H2O2) в сосудистых клетках, который, в свою очередь, обладает вазомоторной ролью. Стоит отметить, что по данным литературы эффекты пероксида водорода на сосудистый тонус могут выражаться как в ослаблении сокращения, так и в его усилении, что определяется множеством факторов: локализацией секреции молекулы, концентрацией, принадлежностью сосуда к тому или иному сосудистому региону и другими факторами (Gao et al., 2003; Leung et al., 2006; Ding et al., 2011; Santiago et al., 2013; Li et al., 2016). В рамках первого года выполнения Проекта мы показали, что сократительные ответы гладкомышечного слоя подкожной артерии крысят (в условиях отсутствия эндотелиального слоя) существенно снижаются в присутствии ингибитора Cu,Zn-SODs. Мы предположили, такое подавление сокращения связано со снижением количества продуцируемого Cu,Zn-SODs H2O2, который, таким образом, в норме обладает проконстрикторным влиянием в сосудах крысят. Данное предположение подтверждается результатами сразу нескольких экспериментальных серий, проведенных в ходе второго года выполнения Проекта. Во-первых, ингибитор Cu,Zn-SODs DETC не влиял на продукцию O2•- в подкожной артерии 10-15-дневных крысят. Данный результат указывает на то, что эффекты DETC в экспериментах по регистрации сократительных ответов изолированных сосудов связаны с изменением продукции H2O2, а не O2•-. Во-вторых, H2O2 сам по себе был способен вызывать сокращение подкожной артерии крысят. В-третьих, полное устранение экзогенного H2O2 (комбинацией супероксиддисмутазы и каталазы) приводило к ослаблению сократительных ответов артерий крысят. ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЙ NO ПОДАВЛЯЕТ АКТИВНОСТЬ Cu,Zn-SODs ПУТЕМ ИХ НИТРОЗИЛИРОВАНИЯ В рамках первого года выполнения Проекта мы показали, что наличие интактного эндотелия нивелирует антиконстрикторный эффект ингибитора Cu,Zn-SODs в подкожной артерии крысят. Иными словами, факторы, продуцируемые эндотелием подавляют функциональный вклад Cu,Zn-SODs в регуляцию сократительных ответов. Поэтому нашим следующим шагом стало ответить на вопросы: (1) какой эндотелиальный «компонент» или сигнальный путь препятствует проявлению эффекта ингибитора Cu,Zn-SODs в артериях крысят, и (2) каким образом осуществляется данный эффект. Мы предположили, что таким «негативным» регулятором активности Cu,Zn-SODs может быть оксид азота (NO). Данное предположение подкреплялось следующими фактами. Во-первых, как продукция, так и функциональный антиконстрикторный вклад эндотелиального NO в периоде раннего постнатального онтогенеза особенно высок, что было показано ранее нашей научной группой (Gaynullina et al., 2013; Sofronova et al., 2016). Во-вторых, Cu,Zn-SODs имеют сайты как нитрозилирования, так и фосфорилирования (Banks and Andersen, 2019), т.е. могут подвергаться регуляторному влиянию напрямую NO, а также активирующимися в результате его сигналлинга киназами, в частности, PKG. Мы показали, что устранение синтеза NO в эндотелии сосудов с помощью ингибитора NO-синтаз L-NNA приводит к тому, что ингибитор Cu,Zn-SODs DETC оказывается способен ослаблять сокращение подкожной артерии крысят, как это ранее наблюдалось в сосудах с механически удаленным эндотелием. То есть именно путь NO не дает проявляться эффекту ингибитора Cu,Zn-SODs DETC в сосудах крысят. Важно отметить, что эффекта DETC не было обнаружено в сосудах крысят после инкубации с ингибитором растворимой гуанилатциклазы – одной из главных мишеней NO в гладкомышечных клетках. Иными словами, устранение растворимой гуанилатциклазы не привело к появлению эффекта ингибитора Cu,Zn-SODs DETC. Поскольку конечным звеном опосредуемого растворимой гуанилатциклазой сигналлинга является активация PKG, можно предположить, что подавление активности Cu,Zn-SODs в присутствии NO не связано с активацией PKG и последующим фосфорилированием Cu,Zn-SODs. Вместе с тем, нам удалось продемонстрировать, что эффект DETC не проявляется в сосудах без эндотелия, когда в растворе присутствует донор NO – нитропруссид натрия. Итак, в сосудах крысят в условиях наличия интактного эндотелия активность Cu,Zn-SODs оказывается снижена из-за прямого воздействия NO на фермент, вероятно, путем нитрозилирования. Подытоживая вышесказанное можно заключить, что проконстрикторная роль продуцируемого Cu,Zn-SODs H2O2 не проявляется в сосудах крысят с интактным эндотелием ввиду подавления активности Cu,Zn-SODs напрямую эндотелиальным NO. ПРОДУКЦИЯ O2•- ЗНАЧИТЕЛЬНО ВЫШЕ В ПОДКОЖНОЙ АРТЕРИИ 10-15-ДНЕВНЫХ КРЫСЯТ, ЧЕМ У ВЗРОСЛЫХ КРЫС Результаты, полученные в ходе первого года выполнения Проекта, демонстрировали как бОльшую экспрессию, так и бОльший функциональный вклад АФК в сосудах крысят в периоде раннего постнатального онтогенеза по сравнению со взрослыми животными. Мы предположили, что продукция АФК будет также выше в ткани артерий крысят. Действительно, используя метод тканевой хемилюминесценции, мы показали, что для подкожной артерии крысят была характерна значительно более высокая базальная продукция O2•- по сравнению со взрослыми. При этом различия в продукции O2•- между артериями взрослых крыс и крысят становились еще более выраженными при стимуляции активности NADPH оксидаз NADPH. Согласно литературе, NADPH оксидаза является ключевым источником O2•-, образующегося в ответ на NADPH (Miller et al., 2005). Чтобы проверить вклад NADPH оксидаз в повышенную продукцию O2•- в подкожной артерии крысят, мы провели эксперименты с пан-ингибитором NADPH оксидаз VAS2870. VAS2870 значительно снизил стимулированную NADPH продукцию O2•- в подкожной артерии крысят, что указывает на существенный вклад NADPH оксидаз в эту реакцию. Таким образом, как базальная, так и стимулированная NADPH продукция O2•- в подкожной артерии крыс уменьшается с по мере взросления, а NADPH оксидазы вносят существенный вклад в продукцию O2•- в артериях 10-15-дневных крысят. ВТОРАЯ ИЗОФОРМА NADPH ОКСИДАЗ (NOX2) ЯВЛЯЕТСЯ НАИБОЛЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗНАЧИМОЙ В ПОДКОЖНОЙ АРТЕРИИ 10-15-ДНЕВНЫХ КРЫСЯТ В ходе первого года выполнения Проекта мы продемонстрировали, что вторая и четвертая изоформы NADPH оксидаз (NOX2 и NOX4, соответственно) представлены в наибольшей степени среди всех изоформ в ткани подкожной артерии как взрослых крыс, так и крысят. При этом известно, что данные изоформы отличаются как локализацией в клетках (NOX2 расположена преимущественно в плазматической мембране, NOX4 – во внутриклеточных компартментах) (Knock, 2019), так и продуцируемыми АФК (NOX2 продуцирует O2•-, а NOX4 – наряду с O2•- продуцирует сразу H2O2) (Miller et al., 2006; Kuroda et al., 2014). При этом большинство функциональных экспериментов было проведено с использованием пан-ингибитора NADPH оксидаз. Таким образом, оставалось неизвестным, какая именно изоформа NADPH оксидаз вносит вклад в регуляцию тонуса артерий крысят. С использованием селективных ингибиторов NOX2 и NOX4 нам удалось показать, что именно NOX2, но не NOX4 вносит вклад в регуляцию тонуса артерий крысят. Аналогично эффекту пан-ингибитора VAS2870, ингибитор NOX2 (GSK2795039) вызывал ослабление сократительных ответов подкожной артерии крысят. При этом селективный ингибитор NOX4 (GKT137831) влияния не оказал. Таким образом, продуцируемые NOX2 АФК обладают проконстрикторным влиянием в подкожной артерии 10-15-дневных крысят. ПРОДУЦИРУЕМЫЕ NADPH ОКСИДАЗАМИ АФК СПОСОБСТВУЮТ СОКРАЩЕНИЮ АРТЕРИЙ КРЫСЯТ ПУТЕМ АКТИВАЦИИ ПОТЕНЦИАЛ-УПРАВЛЯЕМЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ L-ТИПА В рамках первого года выполнения Проекта мы показали, что пан-ингибитор NADPH оксидаз VAS2870 вызывает выраженное ослабление сократительных ответов подкожной артерии крысят, но не взрослых крыс. В отличие от ингибитора Cu,Zn-SODs DETC, эффект VAS2870 в сосудах крысят проявлялся в равной степени как при наличии интактного эндотелия, так и после его удаления, т.е. не зависел от наличия эндотелия. Таким образом, продуцируемые NADPH оксидазами АФК обладают проконстрикторным влиянием в гладкой мышце сосудов крысят. Нашим следующим шагом стало найти мишень, опосредующую такое выраженное проконстрикторное действие. По данным литературы, усиление сокращения под действием продуцируемых NADPH-оксидазами АФК в сосудах взрослых животных может происходить путем активации механизмов, участвующих в увеличении чувствительности сократительного аппарата гладкомышечных клеток к кальцию («кальциевая сенситизация», путем активации ферментов Rho-киназы, протеинкиназы С (PKC), Src-киназы), а также путем непосредственного увеличения концентрации кальция в клетке (путем активации потенциал-управляемых кальциевых каналов L-типа) (Knock, 2019). Примечательно, что механизм кальциевой сенситизации с участием Rho-киназы играет более выраженную функциональную роль в сосудах животных раннего постнатального периода, чем у взрослых (Puzdrova et al., 2014; Mochalov et al., 2018). В связи с этим мы предположили, что более выраженное проконстрикторное влияние продуцируемых NADPH оксидазами АФК может быть связано именно с активацией Rho-киназы, которая более активна в сосудах крысят. Однако данная гипотеза не подтвердилась. Результаты экспериментов с применением ингибиторного анализа продемонстрировали, что эффект ингибитора NADPH оксидаз не устраняется на фоне ингибитора Rho-киназы. Последнее говорит о том, что Rho-киназа не является основной мишенью продуцируемых NADPH оксидазами АФК. Аналогичным образом, подавление активности других участников кальциевой сенситизации, а именно, протеинкиназы С и Src-киназы, не устраняло эффекта пан-ингибитора NADPH оксидаз. Таким образом, проконстрикторное влияние продуцируемых NADPH оксидазами АФК в подкожной артерии 10-15-дневных крысят преимущественно не связано с активацией протеинкиназы С и Src-киназы. Наконец, мы оценили участие LTCC в реакциях сокращения артерий, опосредованных продуцируемыми NADPH оксидазами АФК. Мы показали, что в условиях блокады LTCC пан-ингибитор NADPH оксидаз оказывается не способен подавлять сокращение артерий крысят. Иными словами, проконстрикторное влияние продуцируемых NADPH оксидазами АФК связано с активацией LTCC в гладкой мышце подкожной артерии крысят периода раннего постнатального онтогенеза. По данным литературы, некоторые изоформы NADPH оксидаз активируются в ответ на повышение концентрации ионов Ca2+ (Ameziane-El-Hassani et al., 2005). Поэтому далее мы поставили перед собой задачу ответить на следующий вопрос: входящий через LTCC каналы Ca2+ активирует NADPH оксидазы или же продуцируемые NADPH оксидазой АФК активируют LTCC. Эксперименты с применением метода тканевой хемилюминесценции продемонстрировали, что ни базальная, ни стимулированная NADPH продукция O2•- не изменяется в ответ на блокаду LTCC. Таким образом, мы полагаем, что продуцируемые NADPH оксидазами АФК активируют LTCC, а не Ca2+, поступающий через LTCC, активирует NADPH оксидазы.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".