ИСТИНА

Цель предлагаемого проекта – изучение особенностей протекания конкурентных реакций в тройной системе с участием положительно заряженных «сферических поликатионных щеток» (полистирольных коллоидных частиц с привитыми катионными цепями) и двух типов отрицательно заряженных макроионов: липосом и глобулярного белка. В ходе выполнения проекта будет получена информация о строении тройных комплексов щетка-липосома-белок, влиянии солей на устойчивость полученных комплексов, кинетике реакций обмена в системе с участием щеток, липосом и белка. Это позволит сформулировать условия, которые обеспечивают сохранение целостности липосом после связывания со щетками и стабильность комплекса щетка-липосома в присутствии избыточного количества белка. Исследование цитотоксичности тройных комплексов и внутриклеточной локализации комплекса позволит получить представление о поведение комплексов в клеточной среде. Результаты работы будут использованы для разработки способов «мягкой» (без разрушения) иммобилизации липосом на поверхности дисперсных частиц, сохранения стабильности мультилипосомальных композитов в биологической жидкости и получения новых многокомпонентных биологически активных препаратов.

The purpose of the proposed project is to study the features of the course of competitive reactions in the ternary system involving positively charged "spherical polycationic brushes" (polystyrene colloidal particles with grafted cationic chains) and two types of negatively charged macroions: liposomes and globular protein. In the course of the project, information will be obtained on the structure of ternary brush-liposome-protein complexes, the effect of salts on the stability of the complexes obtained, and the kinetics of the exchange reactions in a system involving brushes, liposomes, and proteins. This will allow us to formulate conditions that ensure the integrity of the liposomes after binding to the brushes and the stability of the brush-liposome complex in the presence of excess protein. The study of the cytotoxicity of ternary complexes and intracellular localization of the complex will provide an idea of ​​the behavior of complexes in the cellular environment. The results of the work will be used to develop methods for "soft" (without destruction) immobilization of liposomes on the surface of dispersed particles, to preserve the stability of multiliposomal composites in a biological fluid, and to obtain new multicomponent biologically active preparations.

Ожидаемые результаты проекта: 1) Состав комплексов щетка-белок и щетка-липосома в растворах с различными значениями рН и концентрациями соли; 2) Время достижения максимального заполнения щеток белком и липосомами в растворах с различными значениями рН и концентрациями соли; 3) Количественное описание устойчивости комплексов щетка-белок и щетка-липосома к диссоциации при изменении рН и концентрации соли; 4) Время достижения максимальной десорбции белка и липосом из их комплексов со щетками при изменении рН и концентрации соли; 5) Состав тройных комплексов щетка-липосома-белок в растворах с различными значениями рН, концентрациями белка и соли; 6) Описание условий получения тройных комплексов с неразрушенными липосомами; 7) Данные по цитоксичности комплексов щетка-белок и щетка-липосома, а также тройных комплексов щетка-липосома-белок; 8) Микрофотографии тройных комплексов, полученные методом криогенной микроскопии; 9) Микрофотографии, отражающие распределение инкапсулированных в липосомы доксорубицина, полученные методом флуоресцентной микроскопии.

Исследовано взаимодействие катионных полимеров с анионными бислойными везикулами (липосомами), сформированными из липидов и их смесей с поверхностно-активными веществами и белками [A.A. Yaroslavov et al., J.Am.Chem.Soc., 133 (2011) 2881; Д.А.Давыдов и др., Коллоид. ж., 73 (2011) 36; N.O. Kozlova et al., Biochim.Biophys.Acta, 1514 (2001) 139]. Показано, что такое взаимодействие сопровождается существенными структурными перестройками и морфологическими изменениями в везикулярных мембранах: латеральной сегрегацией и ускорением трансмембранной миграции липидов [A.A. Yaroslavov et al., Acc. Chem. Res., 39 (2006) 702], встраиванием полимера в липосомальную мембрану [А.А. Ярославов и др., Высокомолек. соед. А, 51 (2009) 962], повышением проницаемости мембраны по отношению к низкомолекулярным веществам [M.V. Kitaeva et al., Langmuir, 20 (2004) 6796], проникновением полимера внутрь липосом [F.M. Menger et al., J. Am. Chem. Soc., 125 (2003) 2846], а также агрегацией, слиянием и разрушением липосом [A.A. Yaroslavov et al., J. Am. Chem. Soc., 133 (2011) 2881–2883]. Предложен и экспериментально подтвержден новый метод для исследования трансмембранной миграции липидов, основанный на измерении электрокинетических характеристик липосом [A.A. Yaroslavov et al., Acc. Chem. Res.; 39 (2006) 702]. Изучена обратимость процессов комплексообразования и индуцированных поликатионами структурных перестроек в анионных липидных мембранах [A.A. Yaroslavov et al., Biochim.Biophys.Acta, 1560 (2002) 14]. Изучены электрические свойства плоских липидных мембран, в том числе мембран со встроенным ионным каналообразователем грамицидином [A.V. Krylov et al., J.Membr.Biol., 189 (2002) 119].

Исследовано формирование комплексов бычьего сывороточного альбумина (БСА) и полимерных (полистирольных) микросфер с привитыми поликатионными цепями диаметром 240 нм («сферических поликатионных щеток», СК+). БСА количественно адсорбируются на поверхности щеток, вызывая нейтрализацию поверхностного заряда щетки и ее перезарядку в избытке белка. Полученные комплексы СК+/БСА устойчивы в физиологическом растворе с 0,15 М концентрацией соли (NaCl). Повышение рН раствора с 5 до 8 приводит к увеличению отрицательного заряда белковой глобулы и, как следствие, уменьшению емкости щеток по белку. Связывание с белком заметно понижает цитотоксичность катионных щеток. Исследованы конкурентные реакции в тройной системе СК+/БСА/анионные липосомы. Добавление БСА к суспензии комплекса СК+/липосома не приводит к вытеснению липосом с поверхности катионных щеток. Полученные результаты важны для понимания поведения катионных частиц и их комплексов с липосомами в биологических средах с высоким содержанием белка. Исследован состав тройных комплексов, состоящих из катионной сферической щетки, анионных липосом и отрицательно заряженного белка в растворах с рН 7, дополнительно содержавших 0,15 М хлорида натрия. Формирование тройных комплексов происходило при условии, что доля анионного липида в мембране липосом составляла не менее 0,25. Связывание белка с комплексами щетка-липосома не приводило к нарушению целостности липосомальных мембран. Показано преимущественное – по сравнению с белком – связывание анионных липосом с поверхностью щеток. Адсорбция анионных липосом и белка на поверхности щеток позволила существенно понизить цитотоксичность катионного носителя. Методами просвечивающей электронной микроскопии были получены микрофотографии, визуализирующие морфологию комплексов щетка/липосомы/БСА – было обнаружено наличие кристаллической фазы (белка) на поверхности щёток. Более детальная информация о морфологии комплексов была получена методом криогенной просвечивающей микроскопии, было продемонстрировано наличие целостных (неразрушенных) липосом в составе тройных насыщенных комплексов. При помощи МТТ-теста были получены данные о цитотоксичности комплексов щетка/липосомы/БСА. Было установлено, что бинарные и тройные комплексы на обладают цитотоксичностью в диапазоне исследуемых концентраций объектов. Включение в липосомы антибиотика- цисплатина, привело к снижению терапевтического действия лекарства- цитотоксичность не регистрировалась при концентрации липосом как минимум 1 мг/мл. В то же время, аккумулирование липосом, заполненных цисплатином в тройные комплексы- щетка/ липосомы/БСА позволило зарегистрировать цитотоксичность, близкую к индивидуальному антибиотику. Таким образом, формирование тройного комплекса позволяет повысить терапевтический эффект липосомальной формы антибиотика. С помощью флуоресцентной микркоскопии были получены микрофотографии, иллюстрирующие взаимодействие тройных комплексов с клеточной мембраной. С помощью комбинаций меченных компонентов тройного комплекса было показано, что все компоненты комплекса адсробируются на мембрану в составе единого комплекса. С использованием оптического пинцета была оценена возможность взаимодействия комплекс- клеточная мембрана в условиях, моделирующих ток крови в различных кровеносных сосудах. Измеренная сила взаимодействия в 18 пН позволяет предполагать, что комплексы могут фиксироваться на поверхности клеток, подверженных действию кровотока мелких капилляров. В то же время в артериях и крупных венах сила взаимодействия комплекс-мембрана недостаточна для противостояния воздействию потока крови.