Роль метаболической пластичности астроцитов в регуляции нейроглиоваскулярных взаимодействий в неокортексе мышей при гипоксии in vivoНИР

Metabolic plasticity of astrocytes in regulation of neurogliovascular interaction in neocortex of mice under hypoxia in vivo

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 12 апреля 2023 г.-31 декабря 2023 г. Роль метаболической пластичности астроцитов в регуляции нейроглиоваскулярных взаимодействий в неокортексе мышей при гипоксии in vivo
Результаты этапа: Мы впервые разработали подход для in vivo мониторинга степени оксигенации крови в сосудах коры мозга мышей и для исследования редокс-состояния цитохромов дыхательной цепи (электронтранспортной, ЭТЦ) идентифицированных нейронов и астроцитов анестезированных или бодрствующих мышей (Рисунки 2 и 3А). Для идентификации нейронов и астроцитов были прведены операции по закалыванию в соматосенсорную кору вирусов, кодирующих гены GFP или NirFP под астроцит-или нейрон-специфическими кодонами, или вирусов, кодирующих ген HyPer 7 (так же под астроцит-или нейрон-специфическими кодонами) – биосенсора на перекись водорода, образующуюся в митохондриях. Спектры комбинационного рассеяния (КР) регистрировали от кровеносных сосудов и клеток в области соматосенсорной коры головного мозга анестезированных или бодрствующих мышей с имплантированными краниальными окнами. Для расчёта степени оксигенации крови был проведён калибровочный эксперимент, в ходе которого производился забор крови из хвостовой артерии животного и регистрация спектров КР при известных степенях насыщения крови кислородом в условиях in vitro. По результатам калибровки был получен поправочный коэффициент, использованный для расчёта степени оксигенации крови в сосудах головного мозга животного. sO2= (I1585*1.44)/(I1547+I1585*1.44)*100% По значению sO2 исследуемые сосуды разделяли на артериолы (оксигенация крови более 85%) и венулы (оксигенация крови менее 85-80%). На Рис. 4 показаны гистограммы локальной оксигенации крови в артериолах и венулах, рассчитанные при помощи предлагаемого нами подхода, полученные значения соответствуют тем, которые известны из литературных данных (Meshalkin EN, Vlasov IuA, Shishkina TN, Okuneva GN, Pinegin SL. Nasyshchenie krovi kislorodom v razlichnykh otdelakh krovenosnoĭ sistemy u zdorovogo cheloveka [Blood oxygen saturation in various regions of the circulatory system in healthy persons]. Kardiologiia. 1982 Nov;22(11):45-9; Collins JA, Rudenski A, Gibson J, Howard L, O'Driscoll R. Relating oxygen partial pressure, saturation and content: the haemoglobin-oxygen dissociation curve. Breathe (Sheff). 2015 Sep;11(3):194-201. doi: 10.1183/20734735.001415.). Мы получили, что спектры, зарегистрированные от нейронов и астроцитов, имеют сходную структуру, представляя собой набор пиков, характерных для восстановленных цитохромов ЭТЦ митохондрий, Phe-остатка в белках, липидах и пептидных связей в белках (Рис.5, таблица 1). При помощи разработанного нами подхода мы впервые показали, что в соматосенсорной коре у взрослых мышей митохондрии астроцитов содержат больше восстановленных цитохромов, чем митохондрии нейронов, что соответствует более высокой загруженности ЭТЦ астроцитов электронами по сравнению с нейронами. Более высокая заполненность ЭТЦ электронами является причиной генерации большего количества О2-. Полученный нами результат объясняет литературные данные о том, что митохондрии астроцитов являются источником бОльшего количества АФК, чем митохондрии нейронов [Lopez-Fabuel et al., PNAS 2016]. 1. Эффект кратковременной и длительной гипоксии и последующей реоксигенации на редокс-состояние митохондрий астроцитов и нейронов, а также на оксигенацию крови в артериолах и венулах. Показано, что кратковременная (2 мин) и долговременная (15 мин) гипоксия оказывают разное влияние на исследованные параметры, характеризующие редокс-состояние ЭТЦ митохондрий. Мы впервые показали, что при кратковременной гипоксии происходит увеличение относительного содержания восстановленных цитохромов С и В-типа относительно липидов (оценено по соотношению I750/I1440) в астроцитах, но не нейронах (Рис.6А), при этом реоксигенация - восстановление исходного уровня О2 во вдыхаемом воздухе - только после 5 минуты начинает снижать относительное содержание восстановленных цитохромов в астроцитах. Длительная (15ти минутная) гипоксия приводит к увеличению относительного содержания восстановленных цитохромов С и В-типов (I750/I1440) в митохондриях обоих типов клеток, однако при этом обнаруженное увеличение восстановленных цитохромов во все исследованные точки времени достоверно выше, чем в нейронах (Рис.6Б). Реоксигенация приводит к постепенному снижению содержания восстановленных цитохромов, на к 11 минуте их количество еще не доходит до исходного значения. Полученные данные свидетельствуют о том, что при кратковременной гипоксии ЭТЦ заполняется электронами только в астроцитах, а при длительной - и в нейронах, и в астроцитах, но в большей степени в астроцитах. В случае кратковременной гипоксии мы обнаружили слабо выраженную тенденцию к деоксигенации крови в венулах и незначительное снижение степени оксигенации крови в артериолах, в то время, как при длительной 15-ти минутной системной гипоксии наблюдается достоверное снижение оксигенации крови в сосудах обоих типов - в артериолах и венулах (Рис. 7, 8). Кроме того, оба типа гипоксий влияли на диаметр сосудов, приводя к их расширению (Рис. 9.А-В). Мы получили КР-карты, показывающие распределение по участку коры восстановленных цитохромов и дГб при нормоксии, 15ти мин гипоксии и через 15 мин после реоксигенации (Рис. 9А-В) Видно, что участки ткани около сосуда неоднородны по содержанию восстановленных цитохромов, что связано с тем, что регистрируемый сигнал идет от митохондрий и, таким образом, по КР-сигналу восстановленных цитохромов мы видим области локализации митохондрий. При гипоксии увеличивается относительное содержание восстановленных цитохромов в митохондриях, что видно, как увеличение интенсивности псевдоцвета, кодирующего соотношение I1126/I1440. Также видно, что при гипоксии увеличивается относительное содержание дГб в сосуде и увеличивается диаметр сосуда. При реоксигенации диаметр сосуда уменьшается, но при этом содержание восстановленных цитохромов не полностью возвращается к исходному уровню. Можно предположить, что астроциты даже при кратковременной гипоксии изменяют активность ЭТЦ и, следовательно, окислительного фосфорилирования и метаболизма в целом, чтобы обеспечить нейроны необходимой метаболической поддержкой. Так, при небольшом изменении - падении - локального содержания О2 в астроцитах может происходить переключение на гликолиз с продукцией лактата, который транспортируется в нейроны, переводится в пируват и используется в цикле Кребса для производства NADH (Machler et al., Cell Metabolism 2016). В этом смысле кратковременная гипоксия может выступать в роли непатологической гипоксии, похожей на локальную гипоксию, возникающую при функциональной нагрузке и активации нейрональных сетей. Астроциты в этом случае выступают в качестве “сенсоров” падения содержания О2 в тканях, меняя свой метаболизм таким образом, чтобы обеспечить лактатом нейроны. Нейроны при короткой гипоксии не меняют редокс-состояние своей ЭТЦ, а при длительной гипоксии снижение содержания кислорода в ткани мозга становится существенным, комплексу IV ЭТЦ начинает не хватать О2, в результате чего в ЭТЦ накапливаются электроны. Мы полагаем, что меньшее по амплитуде увеличение относительного содержания восстановленных цитохромов в ЭТЦ нейронов по сравнению с астроцитами связано с несколькими факторами: (1) ЭТЦ нейронов существует в виде суперкомплексов, а ЭТЦ астроцитов - в виде отдельно расположенных комплексов, в результате чего перенос электронов идет быстрее в ЭТЦ нейронов и кислород может использоваться более эффективно, чем в астроцитах. (2) При гипоксии астроциты переключаются на гликолиз, что дополнительно инактивирует ЭТЦ, приводя к накоплению в ней электронов. Мы предположили, что накопление электронов в ЭТЦ может приводить к генерации супероксид-анион радикала и формированию перекиси водорода, однако при кратковременной гипоксии мы не наблюдали изменение флуоресценции Hyper 7, что говорит об отсутствии изменений в образовании Н2О2. Мы показали, что спектры КР не демонстрируют изменений в спектральных диапазонах 1420-1440 и 800-1000 см-1, что может свидетельствовать об отсутствии окисления липидов и разрушения ДНК. Предположительно это связано с тем, что выбранные условия системной гипоксии являются достаточно мягкими для мыши, не приводя к серьезным повреждениям клеточных структур. Об этом также свидетельствует поведение мышей после экспериментов и отсутствие каких-либо следов повреждения мозга в последующие дни после гипоксии. 2. Изменение редокс-состояния дыхательной цепи митохондрий астроцитов и образование перекиси в митохондриях астроцитов соматосенсорной коры мозга мышей при функциональной нагрузке - локомоции. Мы получили, что при первом акте беге, как и при груминге, обратимо увеличивается относительное содержание восстановленных цитохромов в астроцитах соматосенсорной коры мозга, что свидетельствует об увеличении числа электронов в ЭТЦ астроцитов (Рис. 10). При этом второй акт бега практически не влиял на данный параметр, что говорит о возможном развитии адаптации ЭТЦ митохондрий к данному состоянию. Кроме того, мы показали, что в ЭТЦ митохондрий астроцитов при обоих актах бега обратимо увеличивается генерация перекиси водорода (Рис. 11). Мы полагаем, что Н2О2 образуется вследствие переноса электрона на О2 с образованием О2- и последующим образованием Н2О2 под действием супероксиддисмутазы. Полученные данные подтверждают результаты о генерации перекиси водорода астроцитами, полученные другими авторами, в частности, группой проф. Хуана Боланоса (PNAS, 2016). Мы полагаем, что при кратковременной гипоксии или образуется меньшее количество перекиси,которая не детектируетcя при помощи HyPer 7, или образующийся супероксид-анион радикал дает другие активные формы кислорода, а не перекись. Мы полагаем, что обнаруженное нами накопление электронов в ЭТЦ астроцитов коры мозга мышей при вызванном беге связано с активацией гликолиза, производящего лактат, транспортирующийся в нейроны для обеспечения субстратами цикла Кребса и продукции большего количества NADH, необходимого для работы ЭТЦ и синтеза большего количества АТФ на АТФ-синтазе митохондрий. Для того, чтобы проверить, что при беге ткань мозга не испытывает гипоксию, в следующих этапах выполнения проекта мы проведем эксперименты по мониторингу степени оксигенации крови в сосудах кортекса при гипоксии, а также оценим редокс-состояние ЭТЦ нейронов. 3. Исследование уровня загруженности ЭТЦ митохондрий астроцитов электронами при острой локальной гипоксии, вызванной фототромбозом сосудов. Были получены данные о редокс-состоянии цитохромов типов С и В в ЭТЦ митохондрий астроцитов в условиях локальной гипоксии, индуцированной фототромбозом. В первый час после индукции фототромбоза наблюдалось снижение относительного количества восстановленных цитохромов В-типа относительно общего количества липидов в клетке c последующим повышением относительного количества восстановленных цитохромов В на первые сутки после фототромбоза, при этом относительное количество восстановленного цитохрома С увеличивалось уже через час (рис. 12.А и 12.Б соответственно). Повышения уровней этих параметров свидетельствует о более высокой степени загруженности ЭТЦ электронами. Это может быть связано с развитием условий локальной гипоксии: отток электронов на кислород с восстановленного цитохрома c через комплекс IV ЭТЦ оказывается затруднён. Наряду с этим могут активироваться альтернативные пути передачи электронов на АФК с комплекса III, кофактором которого является цитохром b, что может выражаться в снижении доли его восстановления. Через сутки после индукции фототромбоза наблюдалось восстановление относительного количества восстановленных цитохромов обоих типов до исходного уровня, а на вторые сутки – их снижение. При этом наблюдались различия в изменениях уровней загруженности ЭТЦ электронами на разных участках в ответ на функциональную нагрузку (вызванный бег). До введения бенгальского розового и в первые сутки после индукции фототромбоза выраженного ответа митохондрий астроцитов на уровне цитохрома В, содержащегося в III комплексе ЭТЦ, на локомоцию не наблюдалось (рис. 13.А-В). Однако через 48 часов после индукции фототромбоза было зафиксировано выраженное увеличение относительного количества восстановленного цитохрома В в ответ на оба эпизода локомоции (рис. 13.Г) с последующим снижением до исходного уровня в ходе периодов отдыха. Напротив, для цитохрома С наблюдался противоположный эффект. До индукции фототромбоза в ответ на локомоцию наблюдалось увеличение относительного количества восстановленного цитохрома c относительно общего количества липидов в клетке (рис. 14.А), причём в первый час после индукции фототромбоза амплитуда ответа на первый эпизод локомоции возрастала, и уровень его восстановления не снижался в ходе отдыха, что также может быть связано с недостатком кислорода и затруднением оттока электронов через комплекс IV (рис. 14.Б). При этом через сутки после индукции фототромбоза ответ на локомоцию на уровне цитохрома c пропадал и не восстанавливался через 48 часов. Получены данные о повреждении или гибели астроцитов по КР-сигналу продуктов окисления липидов и продуктов деградации ДНК через разные промежутки времени после индукции фотоповреждения сосуда. Так, на первые или вторые сутки после фототромбоза в спектрах КР появлялись плечи с положением 1420 см-1 у липидного пика с положением максимума 1440 см-1, а также выявлялись пики в области 800-1000 см-1, характерные для пуриновых и пиримидиновых оснований, которые, по всей видимости, появляются в цитоплазме при нарушении структуры ДНК. 4. Оценивание эффективности генерации перекиси водорода за счет фермента оксидазы D-аминокислот (DAAO). На данном этапе мы провели дополнительные работы, связанные с тестированием ферментативного окисления D-аланина и D-серина оксидазой D-аминокислот. Окисление указанных аминокислот ферментом приводит к образованию перекиси водорода [Kalinichenko et al., Redox Biology, 2023]. Данные работы были проведены, чтобы продемонстрировать in vitro работу фермента и сравнить его эффективность по отношению к двум аминокислотным субстратам. В дальнейшем, на третьем году выполнения проекта, мы планируем проводит инъекцию в кору вируса, несущего ген DAAO под астроцитарным или нейрональным промоторами для экспрессии DAAO в определенных клетках для направленной продукции Н2О2 и исследования редокс-состояния клеток при повышенной концентрации перекиси водорода. С использованием серебряных плазмонных наноструктур мы показали, что DAAO эффективнее окисляет D-аланин, чем D-серин, что важно в случае ее применения in vivo, поскольку в клетках мозга D-серин играет важную сигнальную роль. Полученные результаты опубликованы в журнале Биофизика (Бочкова и др. Биофизика, 2023).
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Роль метаболической пластичности астроцитов в регуляции нейроглиоваскулярных взаимодействий в неокортексе мышей при гипоксии in vivo
Результаты этапа: На втором этапе проекта были проведены эксперименты по изучению влияния разных моделей гипоксии, окислительного стресса и функциональной нагрузки (локомоции) на редокс-состояние цитохромов С и В-типов дыхательной (электронтранспортной, ЭТЦ) цепи митохондрий астроцитов и нейронов соматосенсорной коры мозга мышей in vivo. Впервые в модели острой локальной ишемии, вызванной фототромбозом артериолы под действием бенгальского розового мы показали различные изменения в редокс-состоянии ЭТЦ близлежащих нейронов и астроцитов в первый час острой ишемии и через 20 и 40 часов после инициации фототромбоза (при восстановлении кровотока в артериоле через 1.5-2 часа после появления тромба). Так, в астроцитах через 60 минут после тромбирования вены увеличивается степень заполненности ЭТЦ электронами, что может приводить к увеличенной генерации супероксид-анион радикала за счет переноса электрона на молекулу О2 в комплексах I и III. При этом заполненность ЭТЦ электронами снижается до исходного уровня на 20 час после тромбирования сосуда и становится ниже контрольного уровня через 40 часов после инициации фототромбоза. При этом в первый час после образования тромба и до его рассасывания мы не наблюдали увеличения интенсивности флуоресценции биосенсора HyPer 7, что свидетельствует об отсутствии увеличения концентрации перекиси водорода в митохондриях астроцитов в острую фазу локальной ишемии. Мы предполагаем, что во время острой фазы ишемии в астроцитах О2•¯ может не превращаться в H2O2 в митохондриальном матриксе, а скорее в другие реактивные формы, например, ONOO¯ . При этом редокс-состояние ЭТЦ в нейронах существенно не меняется ни в одном из исследованных временных интервалов. Также ни в один из исследуемых временных интервалов мы не обнаружили изменения в белок-липидном составе нейронов и астроцитов, что свидетельствует об отсутствии выраженного повреждения структур клеток при ишемии и реперфузии. При выполнении проекта мы обнаружили, что ЭТЦ митохондрий астроцитов, расположенных около артериол больше загружены электронами, чем ЭТЦ митохондрий астроцитов, расположенных около венул. Мы предполагаем, что это связано с тем, что митохондрии астроцитов около артериол устроены таким образом, чтобы эффективно генерить оксид азота (NO) из нитрита при гипоксии или любых физиологических нагрузках, приводя к NO-опосредованному расширению артериол и усилению поступлению кислорода в ткань мозга из артериол. Мы показали, что при длительной 15-ти минутной гипоксии увеличивается относительное содержание восстановленных цитохромов С и В-типов ЭТЦ митохондрий астроцитов и нейронов соматосенсорной коры мышей, однако при этом не увеличивается концентрация перекиси водорода в матриксе митохондрий и цитоплазме клеток обоих типов. Мы предполагаем, что как и в случае фототромбоза, образующийся в ЭТЦ супероксид-анион радикал может переходить не в Н2О2, а другие формы окислителей. Также были проведены эксперименты по изучению изменения редокс-состояния цитохромов ЭТЦ митохондрий нейронов соматосенсорной коры бодрствующих мышей при вызванном беге по беговой дорожке. Мы показали, что бег сопровождается снижением содержания восстановленных цитохромов в ЭТЦ митохондрий нейронов, что свидетельствует об ускорении электронного транспорта в ЭТЦ для обеспечения более активного синтеза АТФ в АТФ-синтазе. При этом мы не наблюдали образования перекиси в матриксе митохондрий нейронов. Были проведены эксперименты по изучению влияния Н2О2, синтезируемой в цитоплазме нейронов ферментом DAAO - оксидазой D-аминокислот при добавлении D-норвалина. Мы наблюдали снижение относительного количества восстановленных цитохромов С-типа при увеличении относительного содержания восстановленных цитохромов В-типа. Данный результат говорит о том, что ускоряется перенос электронов на участке комлпексIII- цитохром С-комплекс IV, но при этом замедляется перенос электронов в Q-цикле. Но в целом, отсуствуют данные, демонстрирующие явное нарушение работы ЭТЦ и повреждение комплексов ЭТЦ. При этом не происходило изменение белок-липидного состава, что говорит об отсутствии перекисного окисления мембранных структур. Также мы разработали математический анализ для исследования динамики и морфологии митохондрий в астроцитах и показали, что в случае кратковременной двухминутной гипоксии не изменяется морфология и подвижность митохондрий. В дальнейшем разработанные подходы могут быть использованы для исследования влияния различных воздействий (лекарственных препаратов, индукции патологий) на свойства митохондриq нейронов и астроцитов in vivo.
2 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Роль метаболической пластичности астроцитов в регуляции нейроглиоваскулярных взаимодействий в неокортексе мышей при гипоксии in vivo
Результаты этапа:
2 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Роль метаболической пластичности астроцитов в регуляции нейроглиоваскулярных взаимодействий в неокортексе мышей при гипоксии in vivo
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".