ИСТИНА

Целью данной работы является всестороннее изучение особенностей молекулярной биологии эукариотической клетки в разных аспектах её жизнедеятельности. Одна из частей работы посвящена исследованию пространственной организации геномной ДНК в клетках. Накопленные на последние двадцать лет экспериментальные данные говорят о том, что пространственная структура генетического материала является важным уровнем регуляции экспрессии генов, программы репликации и поддержания целостности генетического материала. Соответственно, биофизическое и молекулярно-биологическое описание структур, формируемых хроматином эукариот и нуклеоидом прокариотических организмов, а также раскрытие механизмов их формирования, поддержания и ремоделирования в норме и патологии является критически важным как для дальнейшего понимания фундаментальных основ работы генома, так и для создания задела для разработки инновационных способов диагностики и терапии наследственных, раковых и инфекционных патологий. Следующее направление исследований – это изучение молекулярных основ онкогенеза путем создания модельных линий клеток и характеристике таких линий на различных уровнях от микроскопического до геномного. Другая часть работ направлена на исследование молекулярной биологии митохондрий. Митохондрии – важнейшие органеллы эукариотической клетки, осуществляющие множество критических функций. Вследствие физической обособленности от цитозоля двойной мембраной, исследования молекулярных основ работы митохондрий представляет собой методологически трудную задачу. Данная часть исследований посвящена восполнению пробелов в научных знаниях относительно молекулярных основ функционирования трансляционного аппарата митохондрий в контексте регуляции трансляции отдельных мРНК. В рамках тематики планируется провести изучение структуры и функций белков, локализованных на клеточной поверхности дрожжей, и их способности индуцировать у млекопитающих развитие локальных и системных амилоидозов. Еще одной целью в рамках темы Государственного задания является изучение эволюции структурной организации и экспрессии митохондриального генома у низших эукариот филума Euglenozoa.

В ходе выполнения работ по исследования пространственной организации генома буду получены следующие приоритетные результаты: 1. Будет получен ответ на вопрос о том, способны ли энхансеры и промоторы выступать в качестве точек загрузки когезина на хромосомы. 2. Будет определено, существует ли некая геномная окрестность, внутри которой данный энхансер контролирует уровень представленности когезина на хроматине. 3. Будет получен ответ на вопрос о роли энхансер-опосредованной экструзии в активации тканеспецифичных промоторов. Основным результатом исследований молекулярных механизмов онкогенеза должно стать получение модельных культур на основе клеток человека, несущих различные хромосомные транслокации. Полученные клетки будут охарактеризованы на предмет экспрессии слитого гена, присутствия целевого слитого белка и наличия неспецифических хромосомных аберраций. Анализ пролиферативных свойств, иммунологических маркеров и транскриптомов клеток модельных линий позволит сделать вывод об онкогенности/драйверности моделируемых транслокаций В качестве планируемых результатов в части работ, связанных с митохондриальной трансляцией, предполагается описание молекулярных механизмов взаимодействия различных белков-регуляторов трансляции (например, PTCD2, MRPS27, mtIF3 и TACO1) с миторибосомами и митохондриальными мРНК, кодирующими субъединицы OXPHOS. Для этого будут использованы методы крио-ЭМ, масс-спектрометрии и рибосомного профилирования. Планируется выяснить, как эти белки регулируют инициацию трансляции и сборку миторибосом. Кроме того, будут получены экспериментальные данные (например, с помощью рибосомного профилирования и визуализации), подтверждающие или опровергающие гипотезу о существовании обособленных пулов миторибосом, специализированных на синтезе определённых митохондриальных белков. Эти результаты углубят понимание регуляции митохондриальной трансляции и её роли в клеточной энергетике и патологиях. В ходе изучения молекулярной биологии клеточной поверхности будут выделены клеточные стенки и получены препараты, содержащие интактные и мутированные белки клеточной стенки различной степени очистки, включая препараты гомогенные по данным электрофореза и LC-MS/MS-анализа. В процессе выполнения проекта будут получены результаты, которые позволят сформулировать основные положения о роли, способах закрепления белков и возможных механизмах участия липидов и полифосфатов в процессах формирования клеточной поверхности дрожжей в штаммах с делециями и мутациями генов, кодирующих белки клеточной стенки этих микроорганизмов. Будут выявлены белки дрожжей с наибольшим амилоидогенным потенциалом. Будут определены условия, способствующие и/или препятствующие образованию инсулином фибрилл амилоидного типа, формирование которых было индуцировано этими белками.Будут проведены эксперименты по оценке воздействия белков дрожжей, в первую очередь их клеточной поверхности, на клетки первичных культур млекопитающих и/или на организм мышей, а также на белки из списка наиболее вероятно амилоидизующихся в организме млекопитающих при развитии локальных и системных амилоидозов. Изучаемый контакт клеток млекопитающих и дрожжей осуществляется при развитии микозов различной этиологии, ставших весьма распространённым заболеванием в последнее время, а также при потреблении пищи и кормов, содержащих компоненты клеточной стенки дрожжей в значительном количестве. Последнее является широко распространённым явлением в современном питании человека, а также домашних и сельскохозяйственных животных. Результатом такого контакта по нашим экспериментальным данным и сведениям, опубликованным в литературе, могут явиться амилоидозы. Их развитие и тяжесть течения фиксируют исследования последних лет. Сказанное определяет большую практическую значимость работы, в частности, возможности получения новых биобезопасных штаммов дрожжей со сниженным амилоидогенным потенциалом белков их клеточной поверхности для использования в промышленности. Будут получены новые знания о структуре и функционировании митохондриального генома разных ранее неизученных представителей филума Euglenozoa, представители которого чрезвычайно широко распространены в природе. Эти новые знания расширяют наши представления о возможных типах организации митохондриального генома, а также потенциально могут способствовать выявлению новых ранее неизвестных молекулярных механизмов, связанных с процессингом РНК (так, например, открытие РНК редактирования у трипаносоматид привело к описанию новых ферментов РНК процессинга). Помимо этого, некоторые представители филума являются опасными паразитами человека и животных, играющими по данным ВОЗ важную роль в эпидемиологической обстановке и экономическом развитии ряда стран. Митохондриальный геном у паразитических видов как правило имеет крайне необычные формы организации, что свидетельствует о том, что он, по-видимому, являлся одним из ключевых элементов адаптационного процесса. Изучение особенностей организации и экспрессии митохондриального генома может стать основой для создания лекарственных средств с высокой специфичностью воздействия на паразитов.

Научный задел коллектива отражён в публикациях, содержащих приоритетные результаты в области трёхмерной геномики, эпигенетики, регуляции транскрипции и функционирования когезинового комплекса в интерфазе. Опубликованные работы содержат данные о роли когезин-зависимой экструзии, жидко-жидкостного микрофазного разделения и длинных некодирующих РНК в энхансер-промоторной коммуникации и общей архитектуре ядра. Кроме того, членами коллектива были разработаны и внедрены в исследовательскую практику целый ряд экспериментальных и биоинформатических методов. Научный задел по части работ, связанных с митохондриальной трансляцией, сформирован более чем десятилетним опытом коллектива в данной области. Ключевые достижения включают открытие третьего фактора инициации трансляции у S. cerevisiae и описание его роли как трансляционного активатора мРНК COII. Кроме того, показана функция белка PTCD2 в митохондриях человека как регулятора трансляции мРНК COX3, что позволило раскрыть новые механизмы контроля митохондриальной трансляции. Изучение белка SLIRP также внесло вклад в понимание регуляции трансляции митохондриально кодируемых субъединиц цитохром c-оксидазы. В части исследования молекулярных основ онкогенеза реализуемость обеспечивается существенным теоретическим и экспериментальным заделом коллектива исполнителей. Исполнители имеют опыт создания различных модельных клеточных линий для изучения разных аспектов онкогенеза, владеют техниками редактирования генома (в том числе с использованием CRISPR/Cas и TALEN). Авторы владеют современными биохимическими, цитологическими, молекулярно-биологическими, а также биоинформатическими методами. В работе группы используется специальное программное обеспечение, в том числе являющееся собственной разработкой коллектива. Недавно нами был разработан метод ENIT для проверки гидовых РНК, а также метод скрининга клонов на предмет наличия транслокаций, которые будут использоваться при выполнении заявляемого плана исследований.