ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ФИЦ ПХФ и МХ РАН |
||
Система репарации неканонических пар нуклеотидов (мисматчей) в ДНК (ММR) демонстрирует дуализм в отношении сохранения целостности генома. C одной стороны, MMR препятствует накоплению мутаций, а с другой – проявляет себя как индуктор генетической нестабильности. Фундаментальной задачей проекта является исследование механизма взаимодействия неканонических структур ДНК с белками системы репарации мисматчей. Актуальность этой проблемы связана, в том числе, и с недавно обнаруженной ролью MMR в экспансии (увеличении числа) тринуклеотидных повторов, ассоциированной с тяжелыми наследственными нейродегенеративными заболеваниями. В работе предполагается оценить, способен ли сенсорный белок MutS, основная функция которого заключается в узнавании мисматча, связываться с различными типами неканонических форм ДНК (ДНК-триплексы, G-квадруплексы и др.). Одной из важнейших задач, на решение которой направлен проект, является выяснение возможности белка MutS после связывания с неканонической структурой ДНК активировать пути ее процессинга, в частности, привлекать координирующий белок MutL и эндонуклеазу MutH из E. coli, гидролизующую дочернюю (временно неметилированную по участкам 5'-GATC-3') цепь ДНК. Планируется сконструировать серию протяженных ДНК-дуплексов, содержащих вставки фрагментов, образующих неканонические формы, и участок узнавания эндонуклеазы MutH, а также изучить влияние неканонической структуры ДНК на репарацию мисматча T/G. Кроме неканонических форм, возникающих в результате внутримолекулярных перестроек определенных участков двойной спирали ДНК, механическим препятствием для протекания начальных стадий функционирования системы MMR могут служить комплексы ДНК с малыми молекулами разной специфичности. В ходе выполнения проекта будет охарактеризовано влияние на функционирование системы MMR узкобороздочных лигандов, многие из которых выступают в роли противоопухолевых препаратов.
Оценка способности сенсорного белка MutS, основная функция которого заключается в узнавании мисматча, связываться с различными типами неканонических форм ДНК (ДНК-триплексы, G-квадруплексы и др.). Выяснение возможности белка MutS после связывания с неканонической структурой ДНК активировать пути ее процессинга, в частности, привлекать координирующий белок MutL и эндонуклеазу MutH из E. coli, гидролизующую дочернюю (временно неметилированную по участкам 5'-GATC-3') цепь ДНК.
Международные исследовательские группы с участием молодых ученых | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 3 июня 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Неканонические вторичные структуры ДНК как мишень системы репарации ДНК-мисматчей |
Результаты этапа: Неканонические формы ДНК, образующие сеть важных регуляторных элементов генома, являются в то же время участками повышенной мутагенности и генетической нестабильности. Проект посвящен изучению взаимодействия неканонических структур с белками системы репарации ДНК-мисматчей (MMR) E. coli и оценке их влияния на функционирование этой системы. На первом этапе были созданы модели G-квадруплексов (G4) и ДНК-триплексов, которые можно использовать как ДНК-лиганды для белков системы MMR. В качестве последовательностей, способных генерировать альтернативные формы ДНК, выбраны микросателлитные ди-тетрануклеотидные повторы, широко распространенные в геномах эукариот. С помощью методов УФ- и КД-спектроскопии в разных ионных условиях были изучены структура и стабильность (i) изолированных G-квадруплексов, образованных олигонуклеотидами d(GGGT)4, d(GGT)4 и d(GT)n, (ii) более сложных систем, в которых G4-мотив был вписан в дуплексный контекст. Впервые показано, что параллельный G-квадруплекс, образованный «выпетленным» из двойной спирали фрагментом d(GGGT)4, сосуществует с дуплексной структурой. Для анализа ДНК-триплексов был разработан оригинальный метод контактного тушения флуоресценции, что позволило значительно снизить уровень фонового сигнала от избытка третьей цепи, и блокировать ее самоассоциацию. На модели протяженного линейного ДНК-дуплекса определено, на каком расстоянии от G/T-пары и концов двойной спирали должен располагаться участок узнавания MutH для эффективного гидролиза ДНК. Впервые охарактеризованы кинетические параметры основных стадий взаимодействия MutS, ключевого белка системы MMR, с мисматч-содержащей циклической ДНК. Для этого разработана новая методика кинетического анализа динамически подвижных белково-нуклеиновых комплексов, основанная на регистрации изменения сигналов FRET во времени. | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Исследование механизма взаимодействия неканонических структур ДНК с белками системы репарации «мисматчей» |
Результаты этапа: Методами УФ-спектроскопии и КД определена термодинамическая стабильность и структура G-квадруплексов (G4), образуемых G-богатыми фрагментами микросателлитов человека, которые отличаются числом остатков гуанозина в повторяющейся единице. Показано, что олигонуклеотиды d(GGGT)4 и d(GGT)4 образуют внутримолекулярные параллельные G4, причем температура плавления G-квадруплекса резко уменьшается (более чем на 45о) при переходе от трех- к битетрадным структурам. Повторы d(GT)n не образуют совершенных G4 (одна G-тетрада); элементы такой G-квадруплексной структуры не устойчивы при комнатной температуре и не стабилизируются ионами одновалентных металлов. Для олигонуклеотида d(GGT)4 определена минимальная концентрация ионов К+, способствующая фолдингу квадруплекса, которая, как оказалось, зависит от поддерживающей концентрации ионов Na+. Впервые показано, что при параллельной ориентации цепей в четырехцепочечной структуре фланкирующие G4-мотив комплементарные участки (в олигонуклеотиде d(CACTGG-CC-(GGGT)4-TA-CCAGTG)) не могут образовать двойную спираль из-за стерической удаленности, а только дестабилизируют G-квадруплекс. Изучено влияние охарактеризованных олигонуклеотидов на активность топоизомеразы I, одного из основных клеточных ферментов, и прослежена взаимосвязь между стабильностью образуемых ими квадруплексов и степенью ингибирования фермента. Наиболее активным ингибитором с IC50 равной 0.08 μМ оказался олигонуклеотид d(CACTGG-CC-(GGGT)4-TA-CCAGTG), в котором фланкирующие G4-мотив последовательности уменьшали устойчивость сверхпрочной квадруплексной структуры, образованной d(GGGT)4. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".