Место издания:ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им.Д.И.Менделеева Москва
Первая страница:452
Последняя страница:453
Аннотация:Биокатализаторы и белки все более активно используются во всех отраслях современной науки, промышленности, медицины. Характерной чертой является то, что для практического применения используют ферменты и белки, оптимизированные под конкретную задачу. Известны различные методы неупорядоченного и упорядоченного мутагенеза, которые были успешно применены для этих целей. В настоящее время все более широкое применение находит метод рационального дизайна, отличительной чертой которого являются: 1) предварительный анализ структуры фермента (экспериментальной или модельной), на основании которого выбираются перспективные положения для введения аминокислотных замен; 2) моделирование структуры потенциальных мутантов и отбор лучших и только после этого проводится направленный мутагенез. Такой подход позволяет существенно сократить как количество анализируемых мутантов, так и предсказать и получить мутантные ферменты, которые не могут быть получены методами неупорядоченного мутагенеза (направленная эволюция, генная мозайка и др.).
В наше лаборатории проводятся систематические исследования структуры и функции ряда важных биотехнологических ферментов: формиатдегидрогеназы, оксидазы D аминокислот, пенициллинацилазы, гидролазы эфиров альфа-аминокислот, пероксидазы табака и из корней хрена и др. Для большинства из них экспериментальные структуры были получены нами. Например, только у нас имеется трехмерная структура оксидазы D аминокислот, что обеспечивает лидерство по белковой инженерии этого фермента. В результате применения метода рационального дизайна для каждого фермента было получено до 50 различных мутантов. Эти мутанты были выделены и охарактеризованы. В случае формиатдегидрогеназы были получены новые биокатализаторы регенерации NAD(P)H, которые превосходят все известные мировые аналоги. В случае оксидазы D аминокислот получены мутанты с повышенной термостабильностью и заданным узким профилем субстратной специфичности и повышенной каталитической активностью с цефалоспорином С. В случае пенициллинацилазы сконструирован и получен в активной форме пермутированный фермент, состоящий из одной полипептидной цепи в отличие от природного фермента, являющегося гетеродимером и получающегося путем трехстадийной посттрансляционной модификации. Генно-инженерная гидролаза эфиров альфа позволила достичь в синтезе ряда цефалоспориновых и пенициллиновых антибиотиков выходы до 94-98%. Для пероксидазы табака получены дву рентгеновские структуры с использованием которых получены мутанты с повышенной активностью и операционной стабильностью. В случае ФАД-монооксигеназного домена MICAL и HIV пролилгидроксилазы созданы рекомбинантные штаммы E.coli – суперпродуценты целевых ферментов, разработаны методики их рефолдинга и новые методы детекции активности.
Работа выполнена при финансовой поддержки Российского фонда фундаментальных исследлований (гранты 13-04-01907-а, 13-04-01909-а, 13-04-02013-а, 14-04-00865-a, 14-04-01312-a, 14-04-01625-a, 14-04-01665-a, 14-04-31194-мол_а, 14-04-32011-мол_а, 14-04-32064-мол_а, 14-04-32042-мол_а и 14-04-32309-мол_а.
